NaOH对模板进行预处理改善高(G+C)含量DNA的PCR扩增

DNA 在碱性溶液中不被降解，但一定浓度的碱性溶液可以破坏 DNA 的高级结构，使 DNA 处于变性状态。

NaOH 对模板进行预处理改善高（G + C）含量 DNA 的 PCR 扩增的基本原理是 DNA 在碱性溶液中不被降解，但一定浓度的碱性溶液可以破坏 DNA 的高级结构，使 DNA 处于变性状态。被碱变性的 DNA，在 PCR 反应中不仅易于进行延伸反应，而且易于与引物结合，使 PCR 扩增得以顺利进行。

器材：

480 DNA Thermal Cycler（Perkin Elmer，Norwalk，CT，USA）、电泳仪。

试剂：

① Tag DNA 聚合酶和 dNTP（Stratagene 公司）

② 琼脂糖（Promega 公司）

③ Tris，HC1，KC1，NaAc，MgCl2，NaOH，EDTA，明胶等均为分析纯

NaOH 对模板进行预处理改善高（G + C）含量 DNA 的 PCR 扩增的基本过程可分为如下几步：

A 引物设计根据人内源性反转录病毒序列（genbank No. X16514，400〜1294）设计引物。

正向：5'-ATGCCAGGACAGATGGAG

反向：5'-TGCGGGGGTCTTGAGGGT

PCR 扩增片段长度 894bp。

B 模板处理 HRES-1/1 质粒，克隆有人内源性反转录病毒序列（EMBL accession number X16514），其中部分片段（X16514:1158〜1266）（G + C）含量高达 81%。将 10〜100 ng HRES-1/1 质粒溶于 1 ml 0.4mol/L NaOH 和 0.4 mmol/L EDTA 混合液，在室温处理 10 min。紧接着加 0.1 ml 3mol/L NaAc，混匀后加 2.2 ml（两倍体积）冷的无水乙醇。室温放置 30 min 后，离心（10000 r/min，10 min），沉淀用 70% 乙醇洗涤一次。在空气中干燥。

C 反应体系 NaOH 处理过的 HRES-1/1 质粒溶于 100 μl 含下列成分的 PCR 扩增混合液：

1.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L Tris-Cl（pH8.3），50 mmol/L KC1，200 μmol/L dNTP，0.01% 明胶，1 μmol/L 引物，2.5U Tag DNA 聚合酶

D 反应条件按下面条件进行 30 个循环扩增：95 ℃ 1 min，51 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，再在 72 ℃ 延伸 5 min。

E 产物鉴定 0.8% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 反应产物。

1 由于 HRES1/1 克隆的 HRE 手 1 序列中部分片段（G + C）含量极高 ［81%（G + C），长度 109 bp］，添加甲酰胺（2.5%〜10%）或甘油（5%〜10%）作增强剂没有扩增出 PCR 产物，用沸水浴煮沸 5 min 模板，没有扩增出 PCR 产物，用热 PCR 方法也没有扩增出 PCR 产物。

2 用 NaOH 事先处理（G + C）含量较低的 DNA 模板，不会对 PCR 扩增产生负面影响。