高（G+C）含量DNA的PCR扩增实验

使用增强剂改善高（G + C）含量 DNA 模板的 PCR 扩增的基本原理是许多有机化合物可以与 DNA 中的鸟瞟吟（G）和胞啥呢（C）碱基形成氢键，从而减少 DNA 分子内或分子间 G 和 C 形成的氢键，破坏由 G 和 C 间氢键形成的 DNA 分子二级或三级结构。增强剂不仅可以提高 PCR 产物产量，而且对于提高 PCR 产物的专一性也有帮助，而在扩增较长片段高（G + C）含量 DNA 模板时，增强剂更是必不可少。至今已有许多增强剂应用于高（G + C）含量 PCR 扩增，包括 DMSO（二甲亚碉）、甲酰胺、甘油、甜菜碱（betaine）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、7-脱氮-脱氧鸟嗦吟核昔三磷酸（7-deaza dGTP）、脱氧肌昔（deoxyinosine）以及其它小分子酰胺类（amides）、砚类（sulfones）和亚砚类（sulfoxide）等有机试剂。

NaOH 对模板进行预处理改善高（G + C）含量 DNA 的 PCR 扩增的基本原理是 DNA 在碱性溶液中不被降解，但一定浓度的碱性溶液可以破坏 DNA 的高级结构，使 DNA 处于变性状态。被碱变性的 DNA，在 PCR 反应中不仅易于进行延伸反应，而且易于与引物结合，使 PCR 扩增得以顺利进行。

利用高温 PCR 体系改善高（G + C）含量 DNA 模板的 PCR 扩增的基本原理是高（G + C）含量 DNA 模板形成的二级和三级结构，在高温环境中呈现变性或不完全变性状态。为了不使变性的 DNA 在低温下再次恢复复杂结构，将整个 PCR 扩增过程包括变性、退火和延伸都处于高温条件，使用高 Tm 值引物和耐高温的 DNA 聚合酶，便可以扩增高（G + C）含量 DNA 模板。

高（G + C）含量 DNA 的 PCR 扩增实验的常用应用领域如下：

（一）高（G + C）含量基因或 DNA 片段的扩增

从低等放线菌到高等哺乳动物，基因组中都存在高（G + C）含量 DNA 序列，特别是放线菌 基因组中（G + C）平均含量超过 70%，而且有的基因长度超过 10 kb。为了研究这些高（G + C）含量基因的功能，或者对这些基因进行改造，都需要用 PCR 方法扩增或长或短的 DNA 片段。

（二）检测低丰度高（G + C）含量 DNA 序列

有一种疾病，在感觉神经节中感染了 I 型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus， HSV-1），这种病毒基因组测序已经完成，（G + C）平均含量为 69%，局部达到 80%，其中基因为 HSV-1 的代表序列，其（G + C）含量为 75.5%。为了检测处于潜伏期的 HSV-1，提取组织总 DNA，选取 ICP0 基因中的片段作为 PCR 扩增对象，使用常规 PCR 方法，或者在 PCR 反应体系 中添加 DMSO、甲酰胺，以及提高变性温度、使用热稳定 DNA 聚合酶等，都没有扩增出目的片 段。然而，在 PCR 反应体系中用脱氧黄噤吟（deoxyinosine）核昔三磷酸部分取代鸟嗦吟核昔三 磷酸（dlTP:dGTP = 1:4），可以使 PCR 产物检出灵敏度显著提高，如果用常规的 EB 染色灵 敏度提高 104 倍，如果用同位素标记 Southern 杂交，灵敏度可提高 10⁶ 倍。

（三）高（G + C）含量 DNA 片段序列分析

无论是基因组测序还是对克隆片段验证，都需要对特定的 DNA 序列进行测序分析，但高（G + C）含量的 DNA 片段在 DNA 测序时，由于复杂的空间结构使 DNA 测序信号很弱，或者测 序提前终止。为了检验在瘤变过程中 c-jun 顶助相关基因的变化，先用 PCR 方法扩增研究对象，将 PCR 产物分离后，以其作模板直接进行测序。然而，由于目的片段中（G + C）含量很高，变性 形成的单链 DNA 很快复性，使测序无法进行。此时在测序反应体系中增加 10% DMSO，测序反 应即可顺利完成。研究结果表明，在 JB6 突变体中，其中的一个碱基已由 G 突变为 C。

（四）含高（G + C）含量 DNA 片段质粒的反向 PCR

反向 PCR（inverse PCR， iPCR）在基因突变研究中有重要应用，有关 iPCR 的原理和应用已 有专门章节介绍。当质粒中克隆的外源片段（G + C）含量很高时，iPCR 往往难以完成。如在 pUC18 中克隆 1980 bp Actinomadura R39 DD〉 梭肽酶基因 [74%（G + C]，使用 Taq、Tth、Vent 等多种 DNA 聚合酶，在用常规 iPCR 条件下是不能扩增 4.8 kb 长质粒的。然而，向 PCR 反应体 系中加入 10% 甲酰胺或 DMSO 时，使用 Vent DNA 聚合酶，即可扩增出完整的质粒。