dxy review -- 模板高GC含量问题
丁香园论坛
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xjktony
扩增模板的GC 含量为66%,也不算很高,我做过更高的GC 含量(80%)的PCR.对于这种高GC含量的PCR,要加些DMSO等,以解除其二级结构的影响,当然现在也有专门这种PCR Buffer卖.
vanny
宝生物有这种做高GC含量的酶和buffer,称为LA TAKARA酶,里面有GC buffer,效果还不错。
westernblot
你用DMSO5%加到里面,60%应该不是算高的,如果实在不行,就用advantage 2 high GC taq polymeras.(clontech), 效果好,就是贵了点。
我用的退火温度为60度可见模糊片段,但58度就只有引物二聚体了,
你用高温变性,向95度,5min,后加入taq酶,其余度循环中间用95度,15s,如果TM值高过60,可以考虑用65-62度,增加循环数。
changle
可以用双温法试试,比如35个循环,总变性之后,前五个循环双温即没有延伸,后三十个循环三温,具体温度根据引物Tm值定。我试过效果不错。
mcli
如果基因的5’端含有丰富的GC碱基,设计的PCR引物Tm值很高,用普通PCR很难理想地扩增出此基因。用热启动(hot start)和降落-PCR,能取得了较好效果。在PCR开始时加入Qiagen公司的Hotstar Taq DNA聚合酶,并延长起始变性时间如95℃变性15 min,能使模板DNA完全变性,以便提供最大数量的引物配对位点,可避免引物二聚体和非特异性配对。PCR反应过程中,首先在高于引物Tm值的72℃左右扩增几个循环,然后把退火温度逐渐降到两引物的Tm值附近,在随后的循环中,对退火温度进行梯度实验。这样能保证第一引物-模板杂交事件发生在最互补的反应物之间,即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值,但此时目的扩增产物已开始几何级扩增,在剩下的循环中处于超过任何非特异PCR产物的地位。因此,降落-PCR既能增加反应特异性,又能提高PCR产物的产量。
为你设置循环条件为:①95℃变性15 min;②94℃ 45s,72℃ 30s,退火温度每循环降低2.0℃,72℃ 45s,5个循环;③94℃ 45s,设置退火温度梯度从55℃到65℃ 30s,72℃ 45s,30个循环;④72℃延伸10min。
agct
几点建议:
先优化反应条件,GC丰富的序列,退火温度其实也不用刻意加高
主要是变性温度,预变性96度5分钟然后再加酶(热启动)
一般循环的变性温度用95度比94好,还不行还可以再加高
还有DMSO和甘油,各加到5%就足够了,光加DMSO有的时候会使酶的半衰期下降
扩增模板的GC 含量为66%,也不算很高,我做过更高的GC 含量(80%)的PCR.对于这种高GC含量的PCR,要加些DMSO等,以解除其二级结构的影响,当然现在也有专门这种PCR Buffer卖.
vanny
宝生物有这种做高GC含量的酶和buffer,称为LA TAKARA酶,里面有GC buffer,效果还不错。
westernblot
你用DMSO5%加到里面,60%应该不是算高的,如果实在不行,就用advantage 2 high GC taq polymeras.(clontech), 效果好,就是贵了点。
我用的退火温度为60度可见模糊片段,但58度就只有引物二聚体了,
你用高温变性,向95度,5min,后加入taq酶,其余度循环中间用95度,15s,如果TM值高过60,可以考虑用65-62度,增加循环数。
changle
可以用双温法试试,比如35个循环,总变性之后,前五个循环双温即没有延伸,后三十个循环三温,具体温度根据引物Tm值定。我试过效果不错。
mcli
如果基因的5’端含有丰富的GC碱基,设计的PCR引物Tm值很高,用普通PCR很难理想地扩增出此基因。用热启动(hot start)和降落-PCR,能取得了较好效果。在PCR开始时加入Qiagen公司的Hotstar Taq DNA聚合酶,并延长起始变性时间如95℃变性15 min,能使模板DNA完全变性,以便提供最大数量的引物配对位点,可避免引物二聚体和非特异性配对。PCR反应过程中,首先在高于引物Tm值的72℃左右扩增几个循环,然后把退火温度逐渐降到两引物的Tm值附近,在随后的循环中,对退火温度进行梯度实验。这样能保证第一引物-模板杂交事件发生在最互补的反应物之间,即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值,但此时目的扩增产物已开始几何级扩增,在剩下的循环中处于超过任何非特异PCR产物的地位。因此,降落-PCR既能增加反应特异性,又能提高PCR产物的产量。
为你设置循环条件为:①95℃变性15 min;②94℃ 45s,72℃ 30s,退火温度每循环降低2.0℃,72℃ 45s,5个循环;③94℃ 45s,设置退火温度梯度从55℃到65℃ 30s,72℃ 45s,30个循环;④72℃延伸10min。
agct
几点建议:
先优化反应条件,GC丰富的序列,退火温度其实也不用刻意加高
主要是变性温度,预变性96度5分钟然后再加酶(热启动)
一般循环的变性温度用95度比94好,还不行还可以再加高
还有DMSO和甘油,各加到5%就足够了,光加DMSO有的时候会使酶的半衰期下降