dxy review -- 模板高GC含量问题
丁香园
1063
xjktony
扩增模板的GC 含量为66％,也不算很高,我做过更高的GC 含量(80%)的PCR.对于这种高GC含量的PCR,要加些DMSO等,以解除其二级结构的影响,当然现在也有专门这种PCR Buffer卖.
vanny
宝生物有这种做高GC含量的酶和buffer，称为LA TAKARA酶，里面有GC buffer，效果还不错。
westernblot
你用DMSO5％加到里面，60％应该不是算高的，如果实在不行，就用advantage 2 high GC taq polymeras.（clontech), 效果好，就是贵了点。
我用的退火温度为60度可见模糊片段，但58度就只有引物二聚体了，
你用高温变性，向95度，5min,后加入taq酶，其余度循环中间用95度，15s，如果TM值高过60，可以考虑用65－62度，增加循环数。
changle
可以用双温法试试，比如35个循环，总变性之后，前五个循环双温即没有延伸，后三十个循环三温，具体温度根据引物Tm值定。我试过效果不错。
mcli
如果基因的5’端含有丰富的GC碱基，设计的PCR引物Tm值很高，用普通PCR很难理想地扩增出此基因。用热启动（hot start）和降落-PCR，能取得了较好效果。在PCR开始时加入Qiagen公司的Hotstar Taq DNA聚合酶，并延长起始变性时间如95℃变性15 min，能使模板DNA完全变性，以便提供最大数量的引物配对位点，可避免引物二聚体和非特异性配对。PCR反应过程中，首先在高于引物Tm值的72℃左右扩增几个循环，然后把退火温度逐渐降到两引物的Tm值附近，在随后的循环中，对退火温度进行梯度实验。这样能保证第一引物-模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何级扩增，在剩下的循环中处于超过任何非特异PCR产物的地位。因此，降落-PCR既能增加反应特异性，又能提高PCR产物的产量。
为你设置循环条件为：①95℃变性15 min；②94℃ 45s，72℃ 30s，退火温度每循环降低2.0℃，72℃ 45s，5个循环；③94℃ 45s，设置退火温度梯度从55℃到65℃ 30s，72℃ 45s，30个循环；④72℃延伸10min。
agct
几点建议：
先优化反应条件，GC丰富的序列，退火温度其实也不用刻意加高
主要是变性温度，预变性96度5分钟然后再加酶（热启动）
一般循环的变性温度用95度比94好，还不行还可以再加高
还有DMSO和甘油，各加到5％就足够了，光加DMSO有的时候会使酶的半衰期下降
扩增模板的GC 含量为66％,也不算很高,我做过更高的GC 含量(80%)的PCR.对于这种高GC含量的PCR,要加些DMSO等,以解除其二级结构的影响,当然现在也有专门这种PCR Buffer卖.
vanny
宝生物有这种做高GC含量的酶和buffer，称为LA TAKARA酶，里面有GC buffer，效果还不错。
westernblot
你用DMSO5％加到里面，60％应该不是算高的，如果实在不行，就用advantage 2 high GC taq polymeras.（clontech), 效果好，就是贵了点。
我用的退火温度为60度可见模糊片段，但58度就只有引物二聚体了，
你用高温变性，向95度，5min,后加入taq酶，其余度循环中间用95度，15s，如果TM值高过60，可以考虑用65－62度，增加循环数。
changle
可以用双温法试试，比如35个循环，总变性之后，前五个循环双温即没有延伸，后三十个循环三温，具体温度根据引物Tm值定。我试过效果不错。
mcli
如果基因的5’端含有丰富的GC碱基，设计的PCR引物Tm值很高，用普通PCR很难理想地扩增出此基因。用热启动（hot start）和降落-PCR，能取得了较好效果。在PCR开始时加入Qiagen公司的Hotstar Taq DNA聚合酶，并延长起始变性时间如95℃变性15 min，能使模板DNA完全变性，以便提供最大数量的引物配对位点，可避免引物二聚体和非特异性配对。PCR反应过程中，首先在高于引物Tm值的72℃左右扩增几个循环，然后把退火温度逐渐降到两引物的Tm值附近，在随后的循环中，对退火温度进行梯度实验。这样能保证第一引物-模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何级扩增，在剩下的循环中处于超过任何非特异PCR产物的地位。因此，降落-PCR既能增加反应特异性，又能提高PCR产物的产量。
为你设置循环条件为：①95℃变性15 min；②94℃ 45s，72℃ 30s，退火温度每循环降低2.0℃，72℃ 45s，5个循环；③94℃ 45s，设置退火温度梯度从55℃到65℃ 30s，72℃ 45s，30个循环；④72℃延伸10min。
agct
几点建议：
先优化反应条件，GC丰富的序列，退火温度其实也不用刻意加高
主要是变性温度，预变性96度5分钟然后再加酶（热启动）
一般循环的变性温度用95度比94好，还不行还可以再加高
还有DMSO和甘油，各加到5％就足够了，光加DMSO有的时候会使酶的半衰期下降
