PCR反应体系的模板

PCR 反应体系的模板

 

    几乎所有形式的DNA和RNA都是PCR反应的合适底物，包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA。大多数PCR操作中,对DNA模板的要求都不高,纯度要求亦不严,用量很低。理论上,单拷贝基因都可以扩增,但从高度复杂的DNA样品中进行扩增,可能比从质粒、噬菌体中进行扩增要困难些，如在PCR反应前用机械剪切或稀有限制酶消化基因组DNA可提高产量。

 

    核酸标本来源广泛,可以从纯培养的细胞或微生物中提取,也可以从临床标本(血、尿、粪便、体腔积液、嗽口水等)及其他标本(血斑、毛发、精斑等)中直接提取。无论标本来源如何,待扩增核酸都需部分纯化以去除核酸标本中的DNA聚合酶抑制物。以RNA作为模板进行扩增时,需要逆转录成cDNA后才能进行正常的PCR循环。PCR反应中的模板加入量一般为10² ～10⁵ 个拷贝靶序列。人基因组DNA 1μg相当于3×10⁵ 个单拷贝靶分子;大肠杆菌DNA 1μg相当于3×10⁵ 个靶分子。对于细菌基因组DNA或质粒DNA，每次反应所需量仅为pg到ng级。

 

    扩增靶序列的长度根据不同的要求而不同，目的物一般在500bp以内,以100～300bp为佳。对扩增较长的PCR片段,模板的质量最为重要,在抽提纯化DNA的过程中,应最大限度地避免其损伤。操作时尽可能减少反复吹打,可选用大孔径吸头,以避免对DNA的随机剪切。

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