简介
在 ES 细胞及早期胚胎卵裂球的细胞表面均有特定的抗原，如多能性相关转录因子 Oct4，Sox2，Nanog 和早期胚胎阶段特异性细胞表面抗原 SSEA-1 以及 SSEA 抗原相关的胚胎性标志 ECMA-7 等，这些均是未分化状态 ES 细胞的检测指标。因此，常用单克隆抗体的间接免疫荧光法检测小鼠 ES 细胞表面抗原，作为发育全能性的标志。
材料与仪器
器材：
① 载玻片、盖玻片
② 镊子
试剂：
① PBS、
② 一抗、二抗
③ BSA
④ Hochest 33342（Sigma，14533）
⑤ 封闭液：PBS ＋ 2% BSA
⑥ Antibody buffer: PBS + 1% BSA
⑦ Washing buffer: PBS + 0.01% Tween
步骤
特异标记免疫荧光实验鉴定小鼠干细胞的基本过程为：
1. 将细胞接种于盖玻片上，待细胞生长到可以传代时用 4% 多聚甲醛，室温固定 30 分钟。
2. 洗涤 PBS 洗涤，每次 5 分钟，洗涤 3 次。
3. 非特异位点封闭加入封闭液室温作用 1 小时。
4. 吸去封闭液，加入一抗溶液，4 ℃ 过夜；不同公司生产的不同抗体其作用浓度不同，请参考具体抗体说明书。
5. Washing buffer 洗 3 遍，每次 5 分钟。
6. 与选择的一抗相配，加入相应的二抗溶液，室温反应 1 小时；注意：从此步开始避光。
7. Washing buffer 洗 3 遍，每次 5 分钟。
8. 如果需要附染细胞核，用 Hochest333342，37 ℃ 作用 20 分钟。
9. Washing buffer 洗一遍。
10. 封片每张片加 5 μl 防荧光淬灭剂，用盖玻片慢慢倾斜倒置覆盖于载玻片上，避免产生气泡，指甲油封片。
11. 荧光显微镜下拍照。
来源：丁香实验
