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特异标记免疫荧光实验鉴定小鼠干细胞

相关实验:小鼠胚胎干细胞的鉴定

最新修订时间:

简介

在 ES 细胞及早期胚胎卵裂球的细胞表面均有特定的抗原,如多能性相关转录因子 Oct4,Sox2,Nanog 和早期胚胎阶段特异性细胞表面抗原 SSEA-1 以及 SSEA 抗原相关的胚胎性标志 ECMA-7 等,这些均是未分化状态 ES 细胞的检测指标。因此,常用单克隆抗体的间接免疫荧光法检测小鼠 ES 细胞表面抗原,作为发育全能性的标志。

材料与仪器

器材:

① 载玻片、盖玻片
② 镊子

试剂:

① PBS、
② 一抗、二抗
③ BSA
④ Hochest 33342(Sigma,14533)
⑤ 封闭液:PBS + 2% BSA
⑥ Antibody buffer: PBS + 1% BSA
⑦ Washing buffer: PBS + 0.01% Tween

步骤

特异标记免疫荧光实验鉴定小鼠干细胞的基本过程为:

1. 将细胞接种于盖玻片上,待细胞生长到可以传代时用 4% 多聚甲醛,室温固定 30 分钟。

2. 洗涤 PBS 洗涤,每次 5 分钟,洗涤 3 次。

3. 非特异位点封闭加入封闭液室温作用 1 小时。

4. 吸去封闭液,加入一抗溶液,4 ℃ 过夜;不同公司生产的不同抗体其作用浓度不同,请参考具体抗体说明书。

5. Washing buffer 洗 3 遍,每次 5 分钟。

6. 与选择的一抗相配,加入相应的二抗溶液,室温反应 1 小时;注意:从此步开始避光。

7. Washing buffer 洗 3 遍,每次 5 分钟。

8. 如果需要附染细胞核,用 Hochest333342,37 ℃ 作用 20 分钟。

9. Washing buffer 洗一遍。

10. 封片每张片加 5 μl 防荧光淬灭剂,用盖玻片慢慢倾斜倒置覆盖于载玻片上,避免产生气泡,指甲油封片。

11. 荧光显微镜下拍照。

来源:丁香实验

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