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核型分析鉴定小鼠干细胞

相关实验:小鼠胚胎干细胞的鉴定

最新修订时间:

简介

正常的二倍体核型特征是 ES 细胞全能性的基础,因此需要对所建立的 ES 细胞系的核型进行鉴定分析。

材料与仪器

器材:

① 载玻片、镊子、离心管、移液管、吸管、35 mm 培养皿(Corning,430165)

② 培养箱

试剂:

① Demecolcine(Sigma,D6165)

② Giemsa(Sigma,G4507)


③ NaH2PO(Sigma,S6566)、Na2HPO,(Sigma, S5136)


④ 甲醇、冰醋酸

步骤

核型分析鉴定小鼠干细胞的基本过程为:

1.将需要做核型分析的 ES 传代,通常用一个 35 mmI 皿的细胞做核型,在传代后 25~40 小时向培养皿中加入 0.2 μg/ml democolcin,继续培养 1~2 小时。

2.取出培养皿,用标准传代的消化方法将其消化成单细胞悬液,1200r/min 离心 10 分钟,弃上清,注意:上清要吸得彻底些。

3.加入事先预热至 37 ℃ 的 0.56% KC1 低渗液 4 ml,用滴管吹打成单细胞悬液(较剧烈),37 ℃ 低渗处理 15~20 分钟。

4.配 10 ml 固定液,4 ℃ 冰箱预冷。

5.加入 1 ml 预冷的固定液,轻轻吹吸(用滴管从上到下吹气泡 10 次)后离心 1200 r/min,10 分钟。

6.弃上清,加 4 ml 新鲜预冷的固定液,轻轻吹打成单细胞悬液,放入 4 ℃ 冰箱固定 30 分钟以上。

7.1200 r/min 离心 10 分钟。

8.配 8 ml 固定液,4 ℃ 冰箱预冷;重复步骤 6-8,再固定两次。

9.弃上清,加入少量固定液(0.2~0.6 ml)重悬细胞。

10.取一洁净载玻片(浸泡在无水乙醇中,用前用干净绸布擦干,作好标签),用滴管吸取细胞悬液于载玻片垂直上方 50 cm 以上处滴片,将载片倾斜放置,自然晾干(1 小时以上)。

11.将载玻片倒扣(染色体面向下)于染色盒内,于载玻片和盒面之间加入染液(用滴管贴载片边缘轻轻加入),室温染色 1 小时。

12.将载玻片取下,于自来水中冲洗 30~60 秒,再用蒸馏水冲洗 5 秒钟,自然晾干。

13.显微镜下观察,计数。

来源:丁香实验

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