扫描电子显微镜与样品制备技术

扫描电子显微镜，是一种利用电子束扫描样品表面从而获得样品信息的电子显微镜。它能产生样品表面的高分辨率图像，且图像呈三维。

扫描电子显微镜的基本原理是由电子枪发射出一束极细的电子，在加速电压的作用下，形成高速电子流，经聚光镜和物镜汇聚成电子探针，在样品表面进行扫描。

电子束可激发样品表面（厚约几纳米）使原子外层电子逸出，形成次级电子（同时也产生其他信号）。次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关。击出的次级电子被检测器收集，经视频放大，形成图像信号，传入显像管显示。

电子束照射样品表面与显像管荧光屏上的画面呈同步扫描，即样品表面图像定位点与电子束扫描定位点呈准确对应关系。结果荧光屏上形成样品表面图像，可直接观察和照相。

器材：

青霉素小瓶，滴管等，新单面刀片，导电胶

解剖器材，振荡器，样品盒，石蜡（块或片）

扫描电子显微镜，离子溅射仪，临界点干燥器

干燥器，恒温箱，冰箱。

试剂：

⑥30％、50％、70％、80％、90％、95％乙醇溶液

100％ 乙醇溶液；

扫描电镜标本制备技术的基本过程可分为如下几步：

B. 固定：把标本迅速投入到固定液中，其固定程序与透射电镜标本相同。

C. 导电处理：经锇酸固定的标本，双蒸水清洗2次后，放入2％ 单宁酸中处理10 min，再用双蒸水清洗3次，再放入1％ 锇酸中处理30 min。以上均在4 ℃进行。导电处理就是一种将极细的金属颗粒植入生物标本中，以增强标本导电性的电子染色过程。

D. 脱水：将双蒸水洗过3次的标本依次放入30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％ 的乙醇中各10 min，然后将标本移入醋酸异戊酯中，室温、10 min，以便置换出乙醇。

E. 临界点干燥：迅速将标本移入临界点干燥器的密闭标本室中，打开进气阀门，注入液体CO₂，当其量达到标本室容积的2／3时，关闭阀门，将标本室温度加至40 ℃时，标本室内的压力达120 atm，此时已超过临界点（31.4 ℃，72.8 atm；在临界点时，液态与气态界面消失）。

随后，打开放气阀门，缓缓放气（放气时间不得少于2 h）。气放完后，取出完全干燥的标本。

临界点干燥法是扫描电镜标本制备的一种重要干燥方法，它能消除表面张力，使标本在干燥过程中不损伤、不变形。它是利用物质在临界状态时，其表面张力等于零的特性，使样品的液体完全汽化，并以气体方式排掉，来达到完全干燥的目的。

这样就可以避免表面张力的影响，较好地保存样品的微细结构。此法操作较为方便，所用的时间也不算长，一般约2～3 h即可完成，所以是最为常用的干燥方法。

F. 镀膜：将干燥的标本用导电胶粘在标本台上（观察面向上），把标本台放在离子溅射仪阳极载台上，在低真空（0.01 Torr）条件下，加高压（1200～1400 V），阴极（金属靶）与阳极间形成电场，其间残留的气体分子被电离。

形成的阳离子轰击阴极上的金属靶，使金属原子溅射出来，覆盖在标本表面，形成连续均匀的金属膜（20 nm左右），结果不仅保存了标本的表面形态，而且当电子束射到标本上时易激发大量二次电子，具有良好的导电性，使图像更为清晰。

2. 脱水和干燥处理时，尽量减少因标本收缩导致的人为假象。