丁香实验_LOGO
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

效应细胞 CD107a 标记的流式细胞术检测法测定自然杀伤细胞活性

相关实验:自然杀伤细胞活性测定

最新修订时间:

简介

目前国内外多采用检测 NK 细胞活性来研究不同疾病状态下 NK 细胞功能。CD107a 是 NK 细胞脱颗粒的标志物,其表达水平与 NK 细胞的杀伤活性显著相关,因此 CD107a 分子检测可反映 NK 细胞活性。

原理

效应细胞 CD107a 标记的流式细胞术检测法测定自然杀伤细胞活性的基本原理是 NK 细胞质内含有大量的具有细胞溶解作用的颗粒,在活化作用后,NK 细胞会通过细胞免疫突触将这些颗粒释放到靶细胞中。这些细胞颗粒包括细胞溶解蛋白穿孔素和颗粒酶,其中颗粒酶又包括了在膜上表达的溶酶体相关膜蛋白 1(lysosome-associated membrane protein 1, LAMP1),又称 CD107a,是 NK 细胞脱颗粒的标志物。NK 细胞杀伤靶细胞时,随着脱颗粒的发生,CD107a 分子被转运到细胞膜表面,且 CD107a 分子的表达上调与穿孔素的分泌一致,其表达水平与 NK 细胞的杀伤活性显著相关。因此 CD107a 分子阳性表达的 NK 细胞可代表具有杀伤活性的 NK 细胞。

材料与仪器

试剂:

1. 含 15% FCS 的 RPMI 1640 营养液

仪器:

1. 离心机

2. 显微镜

3. 细胞计数板

4. 96 孔细胞培养板

5. CO2 培养箱

步骤

效应细胞 CD107a 标记的流式细胞术检测法测定自然杀伤细胞活性的基本过程可分为以下几步:

1、效应细胞的制备


常规方法分离人 PBMC 或小鼠脾细胞,洗涤并用含 15% FCS 的 RPMI 1640 营养液悬浮,计数后调整细胞浓度至 1x10/ml 备用。


2、靶细胞的制备


取经 24 小时培养的靶细胞,用完全 RPMI 1640 培养液洗涤 1 次,1000 r/min 离心 5~10 分钟。去上清,用完全 RPMI 1640 培养液重悬后计数,并用 0.5% 锥虫蓝染色检测活性,活细胞应大于 95%,调整细胞浓度至 2x10/ml 备用。


3、效-靶细胞作用


分别计数及收集 K562 细胞及 NK 细胞,400 g,室温离心 10 分钟。用 96 孔 U 型细胞培养板,设立空白对照、阴性、阳性对照及实验组,各 3 孔。除空白对照外,每孔加入 5 μl PE 标记的 CD107a 抗体。在阳性对照孔内加入 10 μl PMA(佛波醇酯,终浓度 2.5 μg/ml)及 10 μl 离子霉素(ionomycin,终浓度 0.5 μg/ml)。设定效/靶细胞(E/T)比例为 1:1~100:1,如 E/T 为 1:1 时,在实验孔中加入 10 μl NK 细胞和 K562 细胞(1 x 10);在空白对照、阴性及阳性对照孔中分别加入 10 μl NK 细胞(1 x 10)。对照组和实验组均加入 400 IU IL-2/ml,用完全 RPMI 1640 培养基加至每孔 200 μl。


置 37 ℃、5% CO2 温箱中培养 6 小时。培养 1 小时后,加入 2 μl 莫能菌素(monensin),以阻断细胞表面 CD107a 分子表达后发生内吞。

收集细胞至流式检测管,离心,去上清,用 1xPBS 清洗 3 遍,加入 100μl 1xPBS 重悬细胞。每管加入 5 μl APC 标记的 CD56 单抗,暗室孵育 30 分钟,离心,去上清,用 1xPBS 清洗 3 遍,1% 多聚甲醛固定,FACS 测定 CD56 + NK 细胞上 CD107a 的表达。

4、结果测定和分析


通过 BD FACSCantoTM 流式细胞仪进行上机检测,以 NK 细胞上 CD107a 表达百分率代表 NK 细胞的杀伤活性。

注意事项

(1)在一定范围内,NK 细胞活性与效靶比值成正比,一般效靶比值应小于 100。

(2)NK 细胞在细胞杀伤实验前,推荐用适当浓度的 IL-2 培养 16 小时以上。

(3)一般情况下,NK 细胞 CD107a 自然表达率 < 10%。

(4)在流式分析时,NK 细胞数尽可能多,特别是 NK 细胞数量较少时,以提高结果可靠性。

(5)加入莫能菌素(monensin),阻断细胞表面 CD107a 分子表达后发生内吞,以免影响结果可靠性。

(6)在实验中加入相关 KIR 抗体,如 KIR2DL1 或 KIR2DL2,可对表达相关受体的 NK 细胞克隆进行功能分析。

来源:丁香实验

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序