乳酸脱氢酶释放实验测定自然杀伤细胞活性

目前国内外多采用检测 NK 细胞活性来研究不同疾病状态下 NK 细胞功能。乳酸脱氢酶释放实验测定自然杀伤细胞活性是依据乳酸脱氢酶的生化反应计算细胞活性。

乳酸脱氢酶释放实验测定自然杀伤细胞活性的基本原理是乳酸脱氢酶（LDH）存在于活细胞胞质内，在正常情况下，不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性增加，LDH 可释放至介质中。释放出来的 LDH 在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶 I（NAD＋）变成还原型辅酶 I（NADH），后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化氮唑蓝（INT）或硝基氯化四氮唑蓝（NBT）形成有色的甲替类化合物，在 490 nm 或 570 nm 波长处有一高吸收峰，利用读取的 A 值（吸收值），经过计算即可得知 NK 细胞活性。

1、效应细胞的制备

常规方法分离人 PBMC 或小鼠脾细胞，洗涤并用含 15％ FCS 的 RPMI 1640 营养液悬浮，计数后调整细胞浓度至 1x10/ml 备用。

2、靶细胞的制备

取经 24 小时培养的靶细胞，用完全 RPMI 1640 培养液洗涤 1 次，1000 r/min 离心 5～10 分钟。去上清，用完全 RPMI 1640 培养液重悬后计数，并用 0.5％ 锥虫蓝染色检测活性，活细胞应大于 95％，调整细胞浓度至 2x10/ml 备用。

3、效-靶细胞作用

将效应细胞和靶细胞各 0.1 ml（E/T ＝ 100:1）加入 96 孔细胞培养板的孔中，每份标本设 3 复孔，同时设靶细胞自然释放对照组（0.1 ml 靶细胞 + 0.1 ml 完全 RPMI 1640 培养液）和最大释放对照组（0.1 ml 靶细胞 ＋ 0.1 ml 1％ NP-40 液），低速离心 1000 r/min，2 分钟后，置 37 ℃、5％ CO₂ 温箱中孵育 2 小时。

4、酶促反应

取出培养物，吸取各孔上清 0.1 ml 于另一培养板孔中，置 37 ℃ 预温 10 分钟，每孔加入新鲜配制的底物溶液 0.1 ml［临用前配制：硝基氯化四氮唑蓝（NBT）4 mg，氧化型辅酶 I 10 mg，吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）1 mg，加蒸馏水 2 ml 溶解，混匀后先丢弃 0.4 ml，再加 1 mol/L 乳酸钠 0.4 ml，然后加入 0.1 mol/L pH7.4 PBS 至 10 ml］，室温避光反应 10～15 分钟。每孔加入 1 mol/L 柠檬酸终止液 30 μl，以终止酶促反应。

5、结果计算

用酶联检测仪在 570 nm 波长下读取各孔 A 值（吸收值），并计算 NK 细胞活性。