从脐带血获取CD34＋细胞培养树突状细胞

人源DC的培养主要是由外周血单核细胞或CD34＊前体细胞与不同的细胞因子组合进行定向诱导产生。

目前诱导DC产生的细胞因子组合有多种，如IL-4联合粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、TNF-α联合GM-CSF、IFN-α联合GM- CSF、IL-15联合GM-CSF、单独TSLP（thymic stromal lymphopoietin，胸腺基质淋巴细胞生成素）进行诱导等，由此产生的DC特性也各不相同。

目前最常用的方法是GM-CSF和IL-4联合诱导外周血单核细胞和TNF-α联合GM-CSF诱导CD34^＋前体细胞产生DC。

从脐带血获取CD34^＋细胞培养树突状细胞的基本原理是DC前体（CD34^＋细胞）在体外具有进一步分化的潜能，在GM-CSF和TNF-α的联合作用下，CD34^＋细胞可被定向诱导分化成树突状细胞。

利用该方法培养DC会产生两种不同的亚群：CD1a＋CD14＃-的LC样DC（Langerhans cell，朗格汉斯细胞）和CD1a CD14^＋的髓系DC。

c-kit配体能够增加培养体系中所有髓系DC的数量，而TGF-β可以促进LC样DC的发育，该方法受血样来源影响较大。

在临床治疗过程中，也可通过给患者提前应用G-CSF增加外周血中DC前体的比例，从外周血中分离CD34^＋细胞来诱导培养DC用于细胞治疗。

试剂：

脐带血、含2 mmol／L EDTA和1％ 胎牛血清的预冷的PBS

聚蔗糖-泛影葡胺溶液（Ficoll-Hypaque）

FBS、完全RPMI 1640培养液

磁珠包被的混合单抗（抗CD3、CD14、CD19和CD56）

磁珠包被的抗人CD34抗体、重组人GM-CSF、重组人TNF-α

仪器：

从脐带血获取CD34＋细胞培养树突状细胞的基本过程可分为以下几步：

（1）Ficoll密度梯度法（或其他合适的方法）分离人脐带血中的单个核细胞。锥虫蓝计数活细胞，用预冷PBS调整细胞浓度为1x10个／ml。

（2）在细胞悬液中加入磁珠包被的混合单抗（抗CD3、CD14、CD19和CD56），4 ℃孵育20分钟后离心洗涤。

用预冷PBS调节细胞浓度至2x10个／ml，用磁性分离装置分离磁珠包被的细胞。

（3）收取阴性细胞，加入磁珠包被的抗人CD34抗体，4 ℃孵育20分钟后离心洗涤，用预冷PBS调节细胞浓度至2x107个／ml，用磁性分离装置分离磁珠包被的细胞。

（4）洗脱阳性细胞，用含有800 IU／ml的GM-CSF、100 IU／ml TNF-α的RPMI 1640调整细胞浓度至1x10个／ml～3x10个／ml，将细胞悬液4 ml／孔接种6孔板。

（5）在培养的第3天，倾斜培养板，吸弃50％ 的上清（注意不要触及细胞），加入等量含有800 IU／ml的GM-CSF、100 IU／ml TNF-α的RPMI 1640。