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从外周血分离单核细胞诱导生成树突状细胞

相关实验:人树突状细胞的培养

最新修订时间:

简介

人源DC的培养主要是由外周血单核细胞或CD34*前体细胞与不同的细胞因子组合进行定向诱导产生。


目前诱导DC产生的细胞因子组合有多种,如IL-4联合粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、TNF-α联合GM-CSF、IFN-α联合GM- CSF、IL-15联合GM-CSF、单独TSLP(thymic stromal lymphopoietin,胸腺基质淋巴细胞生成素)进行诱导等,由此产生的DC特性也各不相同。


目前最常用的方法是GM-CSF和IL-4联合诱导外周血单核细胞和TNF-α联合GM-CSF诱导CD34+前体细胞产生DC。

原理

从外周血分离单核细胞诱导生成树突状细胞的基本原理是外周血单核细胞在GM-CSF和IL-4的作用下可以诱导分化成具有典型细胞学和功能特征的DC。


该方法的DC产出率高,可满足实验及临床需要,是目前应用最广泛的人DC的培养方法。但该方法相对繁琐,耗时较长。

材料与仪器

试剂:


PBS、聚蔗糖-泛影葡胺溶液(Ficoll-Hypaque)


FBS、室温和37 ℃的完全RPMI 1640


磁珠包被的抗人CD14抗体


含2 mmol/L EDTA和1% 胎牛血清的预冷的PBS


室温的14.5% 的碘肽酰胺葡胺溶液、重组人GM-CSF


重组人IL-4及重组人TNF-α


仪器:


解剖手术器材、100 mm培养皿、6孔培养皿

步骤

从外周血分离单核细胞诱导生成树突状细胞的基本过程可分为以下几步:


(1)Ficoll密度梯度法(或其他合适的方法)分离人外周血得到单个核细胞。锥虫蓝计数活细胞,用完全RPMI 1640调整细胞浓度为1x107个/ml。


(2)加入磁珠包被的抗人CD14抗体,4 ℃,孵育20分钟后,离心洗涤,用预冷PBS调节细胞浓度至2x10个/ml,用磁性分离装置分离磁珠包被的细胞。


(3)洗脱阳性细胞,用含有800 IU/ml的GM-CSF、500 IU/ml IL-4的RPMI 1640调整细胞浓度至1x106个/ml。将细胞悬液4 ml/孔接种于6孔板。


(4)在培养的第3天,倾斜培养板,吸弃50% 的上清(注意不要触及细胞),加入等量含有800 IU/ml的GM-CSF 和500 IU/ml IL-4的RPMI 1640。


(5)第5天,加入含有100 IU/ml TNF-α、800 IU/mlGM-CSF、100 IU/ml IL-4的RPMI 1640培养基。

(6)到第8天或第9天用吸管吹吸,收取细胞用于后续研究。

注意事项


TNF-α具有促进DC成熟的作用,可根据实验需要决定是否加入该因子,也可选用其他试剂,如LPS或抗CD40做促成熟之用。

来源:丁香实验

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