【转载】凝胶层析＋亲和层析＋离子交换
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凝胶层析
凝胶层析又称为分子筛层析或凝胶过滤。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用最广，商品名是sephadex型号很多，从G10到G200，它的主要应用范围是：①分级分离各种抗原与抗体；②去掉复合物中的小分子物质。如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片；③分析血清中的免疫复合物；④分子量的测定。
（一）原理
凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。
（二）葡聚糖凝胶的种类与性能
葡聚糖又名右旋糖酐，在它们的长链间以三氯环氧丙烷交联剂交联而成。葡聚糖凝胶具有很强的吸水性，交联度大，吸水性小，相反交联度小，吸水性大。商品名以SephadexG表示，G值越小，交联度越大，吸水性越小，G值越大，交联度越小，吸水性就越大，二者呈反比关系，G值大约为吸水量的10倍。由此可以根据床体积而估算出葡聚糖凝胶干粉的用量。
表 Sephadex1的种类与特性
型号 分离范围（分子量） 吸水量（ml/g） 最小溶胀时（h）20℃～25℃ 100℃ 床体积（ml）/干凝胶（mg）
G10 ＜700 1.0±0.1 3 1 2~3
G15 ＜1 500 1.5±0.2 3 1 2.5~3.5
G25 ＜5 000 2.5±0.2 3 1 4~6
G50 1500～20 000 8.0±0.3 3 1 9~11
G75 3 000～70 000 7.5±0.5 24 1 12~15
G100 4 000～15 000 10.0±1.0 72 1 15~20
G150 5 000～800 000 15.0±1.5 72 1 20~30
G200 5 000～30 0000 20.0±2.0 72 1 30~40
G25、G50有四种颗粒型号：粗（100µ~300µ）、中（50µ~150µ）、细（20µ~80µ）和超细（10µ~40µ）。G75～G200又有两种颗粒型号：中（40µ～120µ），超细（10µ～40µ）。颗粒越细，流速越慢，分离效果越好。
表 DEAE－纤维素与Sephadex1比较
项 目 DEAE纤维素 Sephadex
交换量 小 较大
非特异性吸附 较大 小
分离纯度 较好 好
分离时间 较粗 较长
应用范围 较窄 较宽
预处理 繁琐 方便
（三）试验方法
1．凝胶的选择 根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶，如除盐和除游离的荧光素，则可选用粗、中粒度的G28或G500，G250多用于分离蛋白质单体，G200多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。
2．凝胶的预处理 称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。
表 凝胶量与型号和层析柱大小与规格及凝胶用量
层析柱规格 凝胶的规格和用量（g）
直径（cm） 高（cm） 容量（ml） G25 G50 G100 G200
0.9 15 9.5 2.5 1 0.6 0.3
0.9 30 19 5 2 1.2 0.6
0.9 60 38 10 4 2.5 1.2
1.6 20 40 10 4 2.5 1.2
1.6 40 80 20 8 5.0 2.4
1.6 70 140 35 14 9.0 4.4
1.6 100 200 50 20 12.5 6
2.6 40 210 50 20 12 7
2.6 70 370 90 35 20 12
2.62.6 10060 5301 000 130250 50110 3070 1735
为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次即可。
3．装柱 层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。
装柱过程基本同离子交换层析柱。
4．加样与洗脱 样品体积不宜过多，最好为床体积的1％～5%，最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。
洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl）。
5．洗脱液收集 同离子交换层析。
6．凝胶柱的重复使用与保存 当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。保存方法有三种：
⑴ 在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为0.02%N2N3或0.002%洗必泰）或高压灭菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。
⑵ 用完后，以水冲洗，然后用60%~70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。
⑶ 长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于60℃~80℃干燥后保存。
亲和层析
（一）原理
亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。
此法具有高效、快速、简便等优点。
（二）载体的基本要求和选择
理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。
可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。纤维素的非特异性吸附强。聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体。
琼脂糖凝胶的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。
琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。
（三）试剂与配制
1．Sepharose 4B
2．CNBr（剧毒）
3．抗原或抗体
4．1Mol/L NaHCO3 取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。
5．0.1Mol/L NaHCO3
6．2Mol/L NaOH
7．0.01Mol/L pH7.4 PBS
0.2Mol/L Na2HPO4 38.0ml
0.2Mol/L Na2HPO4 162.0ml
NaCl 32.76g
加水至4 000ml。
8．0.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl缓冲液 甘氨酸15.01g加水至1 000ml，取此液，加0.2Mol/L HCl 84ml加水166ml共500ml。
9．7Mol/L尿素
10．0.2Mol/L NaHCO3,（含0.1Mol/L NaCI）
1Mol/L NaHCO3 100.00ml
NaCl 2.93g
加水至500.00ml。
（四）实验方法
1．琼脂糖活化
⑴ 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗涤，立即转入100ml烧杯中，冰浴置于磁力搅拌器上。
⑵ 在通风橱内称取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入琼脂糖中，小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右，反应10min。在1min~2min迅速调整pH为8.0～11.0维持10min。
⑶ 将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。
2．偶联蛋白 20ml 4B液体相当于一半的固相载体。
⑴ 事先将需偶联的抗原（或抗体）蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析数小时(一般偶联量为10~30mg/g载体)。
⑵ 将活化的琼脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min内，从抽洗到偶联），4℃缓慢搅拌过夜，使蛋白与活化的琼脂结合。
3．装柱
⑴ 选柱：不宜过大，一般以1.5×15cm的层析柱可装偶联蛋白的琼脂糖约30ml。
⑵ 装柱：将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内，拧紧下口夹，让其下沉，数分钟后松开下口夹，使溶液约以1ml/min的速度流出。
⑶ 洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3（含0.1Mol/L NaCl）洗涤至洗出液的OD280＜0.02为止。
收集全部的洗脱液，测得的OD280值×洗脱液的总ml数即为未偶联蛋白的含量，由此可计算偶联率。
4．吸附与解吸附
⑴按床体积1/10加样，浓度为1％～2%，缓慢加入待纯化的抗体（或抗原），用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱，流速为1ml/min，至洗出液OD280＜0.02为止。
⑵加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸－HCl缓冲液，流速1ml/min，收集解吸附下来的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白变性。
5．以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理盐水洗涤，平衡后，可继续使用。保存可加入0.02%Na N3于4℃保存。防止冷冻和干裂。
6．结果判定
⑴ 对解吸附下来的蛋白以圆盘电泳或双相琼脂糖电泳进行纯度鉴定。
⑵ 将纯度好的各管洗脱液合并，以生理盐水透析，然后浓缩或冻干保存。
离子交换
（二）常用离子交换剂的种类与特性
1.离子交换纤维素 离子交换纤维素的种类很多，其种类与特性如表1－1所示。
表1-1 离子交换剂的类型与特点
交换剂 名 称（纤维素） 作 用 基 团 特 点
阴离子交换剂 二乙氨基乙基 DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H 最常用在pH8.6以下
三乙氨基乙基 DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H
氨乙基 AE+-O-C2 H4-N H2
胍乙基 强碱性、极高pH仍有效
阳离子交换剂 羧甲基 CM—-O-CH2-COO— 最常用在pH4以上
磷酸 P－-O- P O2－ 用于低pH
磺甲基 SM－-O-CH2-SO3－
磺乙基 SE－-O-C2H4-SO3－ 强酸性用于极低pH
在交换纤维素中，最常用的是DEAE—纤维素和CM纤维素。由于剂型不同，其理化性质和作用也有所差异。一般而言，微粒型要优于纤维素型，因为微粒型是在纤维素型的基础上进一步提炼而成。它的交换容量大，粒细、比重大，能装成紧密的层析柱，要求分辨力高的实验可用此型纤维素（见表1－2）。
表1-2 商品DEAE—纤维素和C M纤维素的类型和特性
纤维素 形状 长度 交换当量（毫克当量/克） 蛋白质吸附容量（mg /g牛血清白蛋白） 床体积（ml / g）
pH 6.0 pH 7.6
DE-22 改良纤维 12~400 1.0±0.1 450 7.7 7.7
DE-23 改良纤维（除细粒） 18~400 450 8.3 9.1
DE-32 微粒型（干） 24~63 660 6.0 6.7
DE-52 微粒型（湿） 24~63 660 6.0 6.3
DE-11 旧型号 50~250 130
与以上相应型号同 溶菌酶pH5
CM-22 0.6±0.06 600 7.7 7.7
CM-23 600 9.1 9.1
CM-32 1 260 6.8 6.7
CM-52 1.0±0.1 1 260 6.8 6.7
离子交换纤维素的优点为：①离子交换纤维素为开放性长链，具有较大的表面积，吸附容量最大；②离子基团少，排列稀疏，与蛋白质结合不太牢固，易于洗脱；③具有良好的稳定性，洗脱剂的选择范围广。
2．离子交换交联葡聚糖 离子交换交联葡聚糖也是广泛使用的离子交换剂，它与离子交换纤维素不同点是载体不同，常用交联葡聚糖的类型与特性见表1-3。
表1-3 常用交联葡聚糖的类型与特性
类 型 性 能 离子基因 反离子 总交换容量（毫克当量/g）
DEAE-sephadexA-25 弱碱性、阴离子交换剂 DEAE+ Cl— 3.5±0.5
DEAE-sephadexA-50
QAE-sephadex-25 弱碱性、阴离子交换剂 QAE+ Cl— 3.0±0.4
QAE-sephadex A-50
CM-A- sephadex 25 弱碱性、阳离子交换剂 CM— Na+ 4.5±0.5
CM- sephadex A-50
SP- sephadex A-25 强碱性、阳离子交换剂 SP— Na+ 2.3±0.3
SP- sephadex A-50
离子交换交联葡聚糖有如下优点：①不会引起被分离物质的变性或失活；②非特异性吸附少；③交换容量大。
离子交换葡聚糖的选用，一般根据蛋白质的分子量而定。中等分子量（30 000-200 000）一般选A50和C50，而低分子量（＜30 000和高分子量＞200 000）均宜选用A25和C25。
（三）试验方法
阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。交联葡聚糖的预处理只需充分溶胀和平衡，不需要除去细粒碎片和酸碱处理。其他步骤也基本同离子交换纤维素。
1．剂型的选择 根据蛋白质在所用缓冲液pH值下带电荷的种类选择，如pH高于蛋白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白，而CM纤维素用于分离碱性蛋白质。
下面以DEAE-纤维素操作为例，介绍试验方法
2．膨胀活化 此步的目的在于除去杂质，暴露DEAE-纤维素上的极性基团。DEAE-纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是1.0g DEAE-纤维素相当于6ml～8ml柱床体积。
表1－4 分离的血清与所需DEAE—纤维素量及其他条件的大致关系
血清样品量（ml） DEAE需用量（g） 选层析柱规格（cm） 选脱液量（ml）
1~2 2 1×25 100~150
5 5 2×12 200~300
10 10 2×20 300~400
20 20 2×37 400~800
称取所需的量，撒于0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE—纤维素干粉约需15倍NaOH液），浸泡1h左右，不时搅拌。抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤），以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将纤维素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于0.5Mol/L NaOH液中，同样处理，洗至中性。
3．平衡 将DEAE—纤维素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中（即起始缓冲液），静止1h，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的pH值与加入的PB液的pH值相近时为止。
4．装柱 层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言，柱长和柱直径之比为10︰1～20︰1，柱的内径上下要均匀一致。用前将层析柱在清洁液内浸泡处理24h，然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。
装柱时，先剪一块圆形的尼龙纱布（直径与层析柱内径一致），放入层析柱底部。将柱下端连接细塑料管，夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，除去死区及塑料管内的气泡。再将平衡的DEAE－纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装。拧开螺旋夹，使流速至1ml/5min，待缓冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表面层，以免使两次加入的纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制，至柱床体积不变为止。剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于纤维素床表面，以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。继续平衡，使流出液的pH值与流入液的pH值完全一致为止。
5．上样 要层析的样品首先必须用起始缓冲液（4℃）平衡过夜，中间可换液数次。将柱的上端打开，用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱纤维素表层。拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中，快要进完时，加1ml～2ml缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。
样品的加量与DEAE—纤维素有一个最适比的关系，超过这个比值，吸附就不完全，直接影响到分离的纯度。经过粗提的 —球蛋白50mg～100mg，用干重约4g DEAE－纤维素装柱分离，可获得理想结果。
6．洗脱 对于阴离子交换剂而言，洗脱的办法是使pH逐渐降低，而离子浓度逐渐升高。一般的办法，是稳定一个因素而改变另一个因素洗脱。洗脱可采用分段洗脱和连续洗脱法，前者较实用，后者较准确。
表1－5 血清蛋白各成分的吸附与解吸的关系
成 分 等电点 DEAE吸附能力 解吸顺序
白蛋白 4.95.65.17.3 强 弱 后 先
表1－6 血清的分段洗脱成分
NaCl浓度（Mol/L） 0.01Mol/L PB（pH） 洗脱部分
0.025 8.0 IgG
0.030 7.0 IgG
0.040 7.0 运铁蛋白、纤维蛋白原
0.060 6.5 白蛋白、IgA
0.150 6.5 IgM 白蛋白
表1－7 各种Ig解脱吸附条件
不加NaCl PB离子强度（Mol/L） pH Ig 其他
0.01 8.0 IgG
0.025 8.0 IgE
0.035 7.0 IgA
0.040 5.9 球蛋白
0.10 5.8 白蛋白
0.40 5.2~4.5 IgM 球蛋白
7．洗脱液的收集 利用自动分步收集器收集，并以20%磺基水杨酸测试，当蛋白液下来时，开始分管收集，至无蛋白液为止。
8．交换柱的再生 将使用过的DEAE－纤维素移入烧杯中，用2Mol/L NaCl液浸泡，抽滤并洗涤数次。如不立即使用，可加1/10 000的叠氮钠防腐，保存于4℃冰箱中。使用时，再以碱－酸－碱处理。
凝胶层析又称为分子筛层析或凝胶过滤。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用最广，商品名是sephadex型号很多，从G10到G200，它的主要应用范围是：①分级分离各种抗原与抗体；②去掉复合物中的小分子物质。如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片；③分析血清中的免疫复合物；④分子量的测定。
（一）原理
凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。
（二）葡聚糖凝胶的种类与性能
葡聚糖又名右旋糖酐，在它们的长链间以三氯环氧丙烷交联剂交联而成。葡聚糖凝胶具有很强的吸水性，交联度大，吸水性小，相反交联度小，吸水性大。商品名以SephadexG表示，G值越小，交联度越大，吸水性越小，G值越大，交联度越小，吸水性就越大，二者呈反比关系，G值大约为吸水量的10倍。由此可以根据床体积而估算出葡聚糖凝胶干粉的用量。
表 Sephadex1的种类与特性
型号 分离范围（分子量） 吸水量（ml/g） 最小溶胀时（h）20℃～25℃ 100℃ 床体积（ml）/干凝胶（mg）
G10 ＜700 1.0±0.1 3 1 2~3
G15 ＜1 500 1.5±0.2 3 1 2.5~3.5
G25 ＜5 000 2.5±0.2 3 1 4~6
G50 1500～20 000 8.0±0.3 3 1 9~11
G75 3 000～70 000 7.5±0.5 24 1 12~15
G100 4 000～15 000 10.0±1.0 72 1 15~20
G150 5 000～800 000 15.0±1.5 72 1 20~30
G200 5 000～30 0000 20.0±2.0 72 1 30~40
G25、G50有四种颗粒型号：粗（100µ~300µ）、中（50µ~150µ）、细（20µ~80µ）和超细（10µ~40µ）。G75～G200又有两种颗粒型号：中（40µ～120µ），超细（10µ～40µ）。颗粒越细，流速越慢，分离效果越好。
表 DEAE－纤维素与Sephadex1比较
项 目 DEAE纤维素 Sephadex
交换量 小 较大
非特异性吸附 较大 小
分离纯度 较好 好
分离时间 较粗 较长
应用范围 较窄 较宽
预处理 繁琐 方便
（三）试验方法
1．凝胶的选择 根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶，如除盐和除游离的荧光素，则可选用粗、中粒度的G28或G500，G250多用于分离蛋白质单体，G200多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。
2．凝胶的预处理 称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。
表 凝胶量与型号和层析柱大小与规格及凝胶用量
层析柱规格 凝胶的规格和用量（g）
直径（cm） 高（cm） 容量（ml） G25 G50 G100 G200
0.9 15 9.5 2.5 1 0.6 0.3
0.9 30 19 5 2 1.2 0.6
0.9 60 38 10 4 2.5 1.2
1.6 20 40 10 4 2.5 1.2
1.6 40 80 20 8 5.0 2.4
1.6 70 140 35 14 9.0 4.4
1.6 100 200 50 20 12.5 6
2.6 40 210 50 20 12 7
2.6 70 370 90 35 20 12
2.62.6 10060 5301 000 130250 50110 3070 1735
为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次即可。
3．装柱 层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。
装柱过程基本同离子交换层析柱。
4．加样与洗脱 样品体积不宜过多，最好为床体积的1％～5%，最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。
洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl）。
5．洗脱液收集 同离子交换层析。
6．凝胶柱的重复使用与保存 当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。保存方法有三种：
⑴ 在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为0.02%N2N3或0.002%洗必泰）或高压灭菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。
⑵ 用完后，以水冲洗，然后用60%~70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。
⑶ 长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于60℃~80℃干燥后保存。
亲和层析
（一）原理
亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。
此法具有高效、快速、简便等优点。
（二）载体的基本要求和选择
理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。
可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。纤维素的非特异性吸附强。聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体。
琼脂糖凝胶的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。
琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。
（三）试剂与配制
1．Sepharose 4B
2．CNBr（剧毒）
3．抗原或抗体
4．1Mol/L NaHCO3 取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。
5．0.1Mol/L NaHCO3
6．2Mol/L NaOH
7．0.01Mol/L pH7.4 PBS
0.2Mol/L Na2HPO4 38.0ml
0.2Mol/L Na2HPO4 162.0ml
NaCl 32.76g
加水至4 000ml。
8．0.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl缓冲液 甘氨酸15.01g加水至1 000ml，取此液，加0.2Mol/L HCl 84ml加水166ml共500ml。
9．7Mol/L尿素
10．0.2Mol/L NaHCO3,（含0.1Mol/L NaCI）
1Mol/L NaHCO3 100.00ml
NaCl 2.93g
加水至500.00ml。
（四）实验方法
1．琼脂糖活化
⑴ 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗涤，立即转入100ml烧杯中，冰浴置于磁力搅拌器上。
⑵ 在通风橱内称取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入琼脂糖中，小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右，反应10min。在1min~2min迅速调整pH为8.0～11.0维持10min。
⑶ 将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。
2．偶联蛋白 20ml 4B液体相当于一半的固相载体。
⑴ 事先将需偶联的抗原（或抗体）蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析数小时(一般偶联量为10~30mg/g载体)。
⑵ 将活化的琼脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min内，从抽洗到偶联），4℃缓慢搅拌过夜，使蛋白与活化的琼脂结合。
3．装柱
⑴ 选柱：不宜过大，一般以1.5×15cm的层析柱可装偶联蛋白的琼脂糖约30ml。
⑵ 装柱：将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内，拧紧下口夹，让其下沉，数分钟后松开下口夹，使溶液约以1ml/min的速度流出。
⑶ 洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3（含0.1Mol/L NaCl）洗涤至洗出液的OD280＜0.02为止。
收集全部的洗脱液，测得的OD280值×洗脱液的总ml数即为未偶联蛋白的含量，由此可计算偶联率。
4．吸附与解吸附
⑴按床体积1/10加样，浓度为1％～2%，缓慢加入待纯化的抗体（或抗原），用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱，流速为1ml/min，至洗出液OD280＜0.02为止。
⑵加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸－HCl缓冲液，流速1ml/min，收集解吸附下来的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白变性。
5．以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理盐水洗涤，平衡后，可继续使用。保存可加入0.02%Na N3于4℃保存。防止冷冻和干裂。
6．结果判定
⑴ 对解吸附下来的蛋白以圆盘电泳或双相琼脂糖电泳进行纯度鉴定。
⑵ 将纯度好的各管洗脱液合并，以生理盐水透析，然后浓缩或冻干保存。
离子交换
（二）常用离子交换剂的种类与特性
1.离子交换纤维素 离子交换纤维素的种类很多，其种类与特性如表1－1所示。
表1-1 离子交换剂的类型与特点
交换剂 名 称（纤维素） 作 用 基 团 特 点
阴离子交换剂 二乙氨基乙基 DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H 最常用在pH8.6以下
三乙氨基乙基 DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H
氨乙基 AE+-O-C2 H4-N H2
胍乙基 强碱性、极高pH仍有效
阳离子交换剂 羧甲基 CM—-O-CH2-COO— 最常用在pH4以上
磷酸 P－-O- P O2－ 用于低pH
磺甲基 SM－-O-CH2-SO3－
磺乙基 SE－-O-C2H4-SO3－ 强酸性用于极低pH
在交换纤维素中，最常用的是DEAE—纤维素和CM纤维素。由于剂型不同，其理化性质和作用也有所差异。一般而言，微粒型要优于纤维素型，因为微粒型是在纤维素型的基础上进一步提炼而成。它的交换容量大，粒细、比重大，能装成紧密的层析柱，要求分辨力高的实验可用此型纤维素（见表1－2）。
表1-2 商品DEAE—纤维素和C M纤维素的类型和特性
纤维素 形状 长度 交换当量（毫克当量/克） 蛋白质吸附容量（mg /g牛血清白蛋白） 床体积（ml / g）
pH 6.0 pH 7.6
DE-22 改良纤维 12~400 1.0±0.1 450 7.7 7.7
DE-23 改良纤维（除细粒） 18~400 450 8.3 9.1
DE-32 微粒型（干） 24~63 660 6.0 6.7
DE-52 微粒型（湿） 24~63 660 6.0 6.3
DE-11 旧型号 50~250 130
与以上相应型号同 溶菌酶pH5
CM-22 0.6±0.06 600 7.7 7.7
CM-23 600 9.1 9.1
CM-32 1 260 6.8 6.7
CM-52 1.0±0.1 1 260 6.8 6.7
离子交换纤维素的优点为：①离子交换纤维素为开放性长链，具有较大的表面积，吸附容量最大；②离子基团少，排列稀疏，与蛋白质结合不太牢固，易于洗脱；③具有良好的稳定性，洗脱剂的选择范围广。
2．离子交换交联葡聚糖 离子交换交联葡聚糖也是广泛使用的离子交换剂，它与离子交换纤维素不同点是载体不同，常用交联葡聚糖的类型与特性见表1-3。
表1-3 常用交联葡聚糖的类型与特性
类 型 性 能 离子基因 反离子 总交换容量（毫克当量/g）
DEAE-sephadexA-25 弱碱性、阴离子交换剂 DEAE+ Cl— 3.5±0.5
DEAE-sephadexA-50
QAE-sephadex-25 弱碱性、阴离子交换剂 QAE+ Cl— 3.0±0.4
QAE-sephadex A-50
CM-A- sephadex 25 弱碱性、阳离子交换剂 CM— Na+ 4.5±0.5
CM- sephadex A-50
SP- sephadex A-25 强碱性、阳离子交换剂 SP— Na+ 2.3±0.3
SP- sephadex A-50
离子交换交联葡聚糖有如下优点：①不会引起被分离物质的变性或失活；②非特异性吸附少；③交换容量大。
离子交换葡聚糖的选用，一般根据蛋白质的分子量而定。中等分子量（30 000-200 000）一般选A50和C50，而低分子量（＜30 000和高分子量＞200 000）均宜选用A25和C25。
（三）试验方法
阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。交联葡聚糖的预处理只需充分溶胀和平衡，不需要除去细粒碎片和酸碱处理。其他步骤也基本同离子交换纤维素。
1．剂型的选择 根据蛋白质在所用缓冲液pH值下带电荷的种类选择，如pH高于蛋白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白，而CM纤维素用于分离碱性蛋白质。
下面以DEAE-纤维素操作为例，介绍试验方法
2．膨胀活化 此步的目的在于除去杂质，暴露DEAE-纤维素上的极性基团。DEAE-纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是1.0g DEAE-纤维素相当于6ml～8ml柱床体积。
表1－4 分离的血清与所需DEAE—纤维素量及其他条件的大致关系
血清样品量（ml） DEAE需用量（g） 选层析柱规格（cm） 选脱液量（ml）
1~2 2 1×25 100~150
5 5 2×12 200~300
10 10 2×20 300~400
20 20 2×37 400~800
称取所需的量，撒于0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE—纤维素干粉约需15倍NaOH液），浸泡1h左右，不时搅拌。抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤），以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将纤维素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于0.5Mol/L NaOH液中，同样处理，洗至中性。
3．平衡 将DEAE—纤维素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中（即起始缓冲液），静止1h，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的pH值与加入的PB液的pH值相近时为止。
4．装柱 层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言，柱长和柱直径之比为10︰1～20︰1，柱的内径上下要均匀一致。用前将层析柱在清洁液内浸泡处理24h，然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。
装柱时，先剪一块圆形的尼龙纱布（直径与层析柱内径一致），放入层析柱底部。将柱下端连接细塑料管，夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，除去死区及塑料管内的气泡。再将平衡的DEAE－纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装。拧开螺旋夹，使流速至1ml/5min，待缓冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表面层，以免使两次加入的纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制，至柱床体积不变为止。剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于纤维素床表面，以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。继续平衡，使流出液的pH值与流入液的pH值完全一致为止。
5．上样 要层析的样品首先必须用起始缓冲液（4℃）平衡过夜，中间可换液数次。将柱的上端打开，用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱纤维素表层。拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中，快要进完时，加1ml～2ml缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。
样品的加量与DEAE—纤维素有一个最适比的关系，超过这个比值，吸附就不完全，直接影响到分离的纯度。经过粗提的 —球蛋白50mg～100mg，用干重约4g DEAE－纤维素装柱分离，可获得理想结果。
6．洗脱 对于阴离子交换剂而言，洗脱的办法是使pH逐渐降低，而离子浓度逐渐升高。一般的办法，是稳定一个因素而改变另一个因素洗脱。洗脱可采用分段洗脱和连续洗脱法，前者较实用，后者较准确。
表1－5 血清蛋白各成分的吸附与解吸的关系
成 分 等电点 DEAE吸附能力 解吸顺序
白蛋白 4.95.65.17.3 强 弱 后 先
表1－6 血清的分段洗脱成分
NaCl浓度（Mol/L） 0.01Mol/L PB（pH） 洗脱部分
0.025 8.0 IgG
0.030 7.0 IgG
0.040 7.0 运铁蛋白、纤维蛋白原
0.060 6.5 白蛋白、IgA
0.150 6.5 IgM 白蛋白
表1－7 各种Ig解脱吸附条件
不加NaCl PB离子强度（Mol/L） pH Ig 其他
0.01 8.0 IgG
0.025 8.0 IgE
0.035 7.0 IgA
0.040 5.9 球蛋白
0.10 5.8 白蛋白
0.40 5.2~4.5 IgM 球蛋白
7．洗脱液的收集 利用自动分步收集器收集，并以20%磺基水杨酸测试，当蛋白液下来时，开始分管收集，至无蛋白液为止。
8．交换柱的再生 将使用过的DEAE－纤维素移入烧杯中，用2Mol/L NaCl液浸泡，抽滤并洗涤数次。如不立即使用，可加1/10 000的叠氮钠防腐，保存于4℃冰箱中。使用时，再以碱－酸－碱处理。
