【原创】＋【讨论】引物设计时3‘端末位碱基有多种说法，欢迎大家参与讨论？
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引物设计时3’端末位碱基的问题，有多种版本：
1、《PCR Cloning protocols》P20： Primers should end (3') in a G or C, or CG or GC，this prevents “breathing” of ends and increases efficiency of priming。
2、《分子克隆》第3版P608：如果可能的话，每个引物的3‘端碱基应为C或G，但不推荐使用――NNGC或NNCG，引物末端碱基GC高的自由能可促进发夹结构的形成，还可产生引物二聚体
3、《现代分子生物学实验技术》第二版P461：引物的3‘端最好选择C、G、T，而不选A。当末位碱基为A时，即使在错配的情况下，也能引发链的合成，导致错误引发。
4、中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所张新宇，高燕宁两位作者的论文《PCR引物设计及软件使用技巧》：引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A
5、《PCR引物设计及软件使用技巧》中这段话是参考了论文《寡核苷酸的优化设计》及《PCR基因扩增实验操作手册》这本书的P59
6、《PCR基因扩增实验操作手册》的P59是参考了PMID号为2179874的题名为Effects of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction: human immunodeficiency virus type 1 model studies这篇文献。该篇文献的摘要提到：Single internal mismatches had no significant effect on PCR product yield while those at the 3'-terminal base had varied effects. A:G, G:A, and C:C mismatches reduced overall PCR product yield about 100-fold, A:A mismatches about 20-fold.It should be noted that mismatches of T with either G, C, or T had a minimal effect on PCR product yield。同时参见tableIII。本人英文水平有限，我的理解是：一些病原体的目的基因序列可能存在着某些位点的突变。如果引物的3’端末位碱基是C时，本应与模板的碱基G结合，当该碱基突变成C时，则目的基因扩增减少100倍。如果引物的3’端末位碱基是G时，本应与模板的碱基C结合，当该碱基突变成A时，则目的基因扩增减少100倍。如果引物的3’端末位碱基是A时，本应与模板的碱基T结合，当该碱基突变成G时，则目的基因扩增减少100倍，当该碱基突变成A时，则目的基因扩增减少20倍。如果引物的3‘端末位碱基设计成T的话，应该与模板的碱基A结合，当该模板的碱基突变成T、C或G时，则该目的条带的扩增没有变化。因此设计的引物3’端末位碱基选择T最好，因为此时待扩增的目的基因与设计的引物的3‘端结合的位点即使突变了，那对扩增的目的条带的产量并没有什么影响。而引物3‘端末位碱基如果选择A时，则有可能导致待扩的目的基因的产量减少20倍【碱基突变成A】、100倍【碱基突变成G】
1、《PCR Cloning protocols》P20： Primers should end (3') in a G or C, or CG or GC，this prevents “breathing” of ends and increases efficiency of priming。
2、《分子克隆》第3版P608：如果可能的话，每个引物的3‘端碱基应为C或G，但不推荐使用――NNGC或NNCG，引物末端碱基GC高的自由能可促进发夹结构的形成，还可产生引物二聚体
3、《现代分子生物学实验技术》第二版P461：引物的3‘端最好选择C、G、T，而不选A。当末位碱基为A时，即使在错配的情况下，也能引发链的合成，导致错误引发。
4、中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所张新宇，高燕宁两位作者的论文《PCR引物设计及软件使用技巧》：引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A
5、《PCR引物设计及软件使用技巧》中这段话是参考了论文《寡核苷酸的优化设计》及《PCR基因扩增实验操作手册》这本书的P59
6、《PCR基因扩增实验操作手册》的P59是参考了PMID号为2179874的题名为Effects of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction: human immunodeficiency virus type 1 model studies这篇文献。该篇文献的摘要提到：Single internal mismatches had no significant effect on PCR product yield while those at the 3'-terminal base had varied effects. A:G, G:A, and C:C mismatches reduced overall PCR product yield about 100-fold, A:A mismatches about 20-fold.It should be noted that mismatches of T with either G, C, or T had a minimal effect on PCR product yield。同时参见tableIII。本人英文水平有限，我的理解是：一些病原体的目的基因序列可能存在着某些位点的突变。如果引物的3’端末位碱基是C时，本应与模板的碱基G结合，当该碱基突变成C时，则目的基因扩增减少100倍。如果引物的3’端末位碱基是G时，本应与模板的碱基C结合，当该碱基突变成A时，则目的基因扩增减少100倍。如果引物的3’端末位碱基是A时，本应与模板的碱基T结合，当该碱基突变成G时，则目的基因扩增减少100倍，当该碱基突变成A时，则目的基因扩增减少20倍。如果引物的3‘端末位碱基设计成T的话，应该与模板的碱基A结合，当该模板的碱基突变成T、C或G时，则该目的条带的扩增没有变化。因此设计的引物3’端末位碱基选择T最好，因为此时待扩增的目的基因与设计的引物的3‘端结合的位点即使突变了，那对扩增的目的条带的产量并没有什么影响。而引物3‘端末位碱基如果选择A时，则有可能导致待扩的目的基因的产量减少20倍【碱基突变成A】、100倍【碱基突变成G】
