碱性磷酸酶染色技术

碱性磷酸酶染色技术是基于碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）与钙化作用密切相关。

碱性磷酸酶染色技术的基本原理是碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）与钙化作用密切相关，因此，以β甘油磷酸钠为底物，在酶的作用下，产生磷酸离子与钙离子形成磷酸钙为第一反应产物。经硝酸铅处理变为磷酸铅沉淀，为第二反应产物。两种反应产物均易解离，进一步用稀释的硫化铵处理，形成稳定的硫化铅颗粒，沉淀于微血管内皮中，定位于酶活性所在之处，光镜下呈黑色。

器材：10 ml 染缸、恒温水浴箱、冰冻切片（或石蜡切片）。

试剂：

① 福尔马林钙固定液

② 巴比妥钠

③ β-甘油磷酸钠

④ 无水氯化钙

⑤ 硫酸镁

⑥ 双蒸水

⑧ 2％ 硝酸钴

⑨ 1％ 硫化铵

⑩ 甘油或甘油明胶封片

⑪ 作用液（① 2％ 巴比妥钠 2.5 ml；② 3％ β-甘油磷酸钠 2.5 ml；③ 2％ 无水氯化钙 5 ml；④ 5％ 硫酸镁 0.25 ml；⑤ 双蒸水 1.25 ml。混合后 pH 为 9.4 左右，37 ℃ 预温 10～15 min。）

碱性磷酸酶染色技术的基本过程可分为如下几步：

A. 冰冻切片经福尔马林钙（FCa）固定 15 min。

B. 蒸馏水洗。

C. 进入作用液 10 min（37 ℃）。

E. 2％ 硝酸钴 5 min。

F. 蒸馏水洗。

G. 1％ 硫化铵 1～2 min（显棕黑色）。

H. 蒸馏水洗。

I. 甘油明胶封片。

注意事项：（对照片制作：免去底物，以蒸馏水代替 3％ β-甘油磷酸钠。进入作用液前先经过 90 ℃ 蒸馏水 10 min，再入作用液。）

1. 石蜡切片作酶反应可不脱蜡进作用液，也可先脱蜡至水再进作用液（推荐）。