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冰冻切片技术(组织学基本技术)

相关实验:组织学基本技术

最新修订时间:

简介

冰冻切片技术具有快速、方便的特点。此外,因其不经过脱水和透明步骤,组织没有收缩,可更好地保持生活的原有形态,尤其在免疫组织化学染色中,能较好地保存细胞抗原的免疫性、脂肪组织、神经组织,特别是酶的活性。

原理

冰冻切片技术的基本原理是利用低温(如液氮、-80 ℃ 冰箱)使组织迅速冻结达到一定的硬度后进行切片。

用途

冰冻切片技术可用于现代免疫荧光诊断和免疫组织化学中。

材料与仪器

器材:冷冻切片机(冷冻箱中的一台切片机,箱内温度可达 -60 ℃ 左右,可随意调节,并在箱表面上的荧屏显示出来)、与冷冻切片机配套的持物托、刀片、磨砂载玻片(原位杂交、免疫组化专用)、冰盒(备用于运输组织)。

试剂:OCT 黏合剂或称包埋剂

步骤

1、取材。常规大小为 2.5 cm x 1.5 cm x 0.3 cm 新鲜的组织标本,尽量切掉四周的脂肪组织。若有水,应用吸水纸将组织块的水分充分吸干,切忌将标本浸入甲醛乙醇、生理盐水。若不及时切片,组织立即放入液氮或 -80 ℃ 冰箱保存。

2、将组织放在持物托上,滴入 OCT 包埋剂,放入液氮中保持平面一致,待液氮泡影消失后再放入冰冻切片机切片,紧急时也可将组织放在持物托上滴入 OCT 包埋剂后直接放入恒温箱中冷冻 10 min 后切片。

3、持物托紧于切片机上的持承器,启动进退键,转动旋把,将组织修平。切片机进退应该均匀无阻力,切片前要检查切片机上所有螺旋是否紧固。

4、调整欲切厚度。根据不同的组织而定,原则上是细胞密集的薄切,纤维多、细胞稀的组织可稍为厚切。常规切片的厚度为 3~10 μm。

5、调整防卷板及切片。制作冰冻切片,关键在于防卷板的调节,要求操作者细心,准确地将其调至适当的位置。切片时,切出的切片才能在第一时间顺利地通过刀与防卷板间的通道,平整地躺在持刀器的钢板上。这时便可掀起防卷板,取室温中的载玻片贴片,利用温度差使切片与载玻片牢固地附贴在一起。

6、根据实验要求选择固定液和染色。若不及时染色,切片也可固定 10 min,待固定液挥发后密封,-20 ℃ 冰箱短期保存。

注意事项

1、冷冻切片机如不是长期开机,使用前应提前 4~6 h 开机可达到稳定温度。

2、临床快速冰冻切片,一般不需要预先固定,固定了的组织,反而增加切片的难度。如使用未完全固定了的组织进行冰冻切片,则固定液中的水分可渗入到组织,当冰冻发生时,水分可存留于组织中,易形成冰晶,最终影响染色结果的观察。

3、视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低,主要根据不同的组织而定,不能一概而论。如:切未经固定的脑组织、肝组织和淋巴结时,冷冻箱中的温度不宜调太低,一般在 -10~-15 ℃ 左右,切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时,可调在 -15~-20 ℃ 左右,切脂肪的组织时,应调至 -25~-30 ℃ 左右。

4、冷冻切片若不及时染色,转送中应使用冰盒。

常见问题

1、切片皱缩或卷缩对制片的影响

冰冻切片皱缩、卷缩常见的原因有:

① 刀锋变钝。

② 防卷板粘有异物,防卷板的作用是防止切片卷缩,但若粘有异物,切片时组织会被挤压而缩在一起。

③ 防卷板与刀锋的位置不平行、不协调。

④ 组织块包埋不完全,缺乏支撑作用。

预防与处理的方法:

① 注意检查刀具,及时更换刀口,定期磨刀。

② 保持防卷板的清洁,每做一例冷冻切片,均应将刀口及防卷板拭擦干净,防止切片的污染和切片皱缩。

③ 调整刀、防卷板的位置,保证两者平行,且防卷板次刀锋前 0.2 mm 左右。

④ 句理组织应完全,没法切片者再滴加包埋胶。

2、组织块脱落对切片的影响

冷冻切片一般要求在 30 min 内发出病理报告,以便手术医生能尽快选择手术方式。

组织块脱落常见原因有:

冻头在冷冻机内放置时间过长,致使包埋胶还来不及渗到冻头的底部便凝固了,导致包埋胶与冻头粘连不紧,稍受外力的作用便脱落。

来源:丁香实验

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