冰冻切片技术（组织学基本技术）

冰冻切片技术具有快速、方便的特点。此外，因其不经过脱水和透明步骤，组织没有收缩，可更好地保持生活的原有形态，尤其在免疫组织化学染色中，能较好地保存细胞抗原的免疫性、脂肪组织、神经组织，特别是酶的活性。

器材：冷冻切片机（冷冻箱中的一台切片机，箱内温度可达 -60 ℃ 左右，可随意调节，并在箱表面上的荧屏显示出来）、与冷冻切片机配套的持物托、刀片、磨砂载玻片（原位杂交、免疫组化专用）、冰盒（备用于运输组织）。

试剂：OCT 黏合剂或称包埋剂

1、取材。常规大小为 2.5 cm x 1.5 cm x 0.3 cm 新鲜的组织标本，尽量切掉四周的脂肪组织。若有水，应用吸水纸将组织块的水分充分吸干，切忌将标本浸入甲醛乙醇、生理盐水。若不及时切片，组织立即放入液氮或 -80 ℃ 冰箱保存。

2、将组织放在持物托上，滴入 OCT 包埋剂，放入液氮中保持平面一致，待液氮泡影消失后再放入冰冻切片机切片，紧急时也可将组织放在持物托上滴入 OCT 包埋剂后直接放入恒温箱中冷冻 10 min 后切片。

3、持物托紧于切片机上的持承器，启动进退键，转动旋把，将组织修平。切片机进退应该均匀无阻力，切片前要检查切片机上所有螺旋是否紧固。

4、调整欲切厚度。根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多、细胞稀的组织可稍为厚切。常规切片的厚度为 3～10 μm。

5、调整防卷板及切片。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节，要求操作者细心，准确地将其调至适当的位置。切片时，切出的切片才能在第一时间顺利地通过刀与防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的钢板上。这时便可掀起防卷板，取室温中的载玻片贴片，利用温度差使切片与载玻片牢固地附贴在一起。

6、根据实验要求选择固定液和染色。若不及时染色，切片也可固定 10 min，待固定液挥发后密封，-20 ℃ 冰箱短期保存。

1、冷冻切片机如不是长期开机，使用前应提前 4～6 h 开机可达到稳定温度。

2、临床快速冰冻切片，一般不需要预先固定，固定了的组织，反而增加切片的难度。如使用未完全固定了的组织进行冰冻切片，则固定液中的水分可渗入到组织，当冰冻发生时，水分可存留于组织中，易形成冰晶，最终影响染色结果的观察。

3、视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织、肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不宜调太低，一般在 -10～-15 ℃ 左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在 -15～-20 ℃ 左右，切脂肪的组织时，应调至 -25～-30 ℃ 左右。

4、冷冻切片若不及时染色，转送中应使用冰盒。

1、切片皱缩或卷缩对制片的影响

冰冻切片皱缩、卷缩常见的原因有：

① 刀锋变钝。

② 防卷板粘有异物，防卷板的作用是防止切片卷缩，但若粘有异物，切片时组织会被挤压而缩在一起。

③ 防卷板与刀锋的位置不平行、不协调。

④ 组织块包埋不完全，缺乏支撑作用。

预防与处理的方法：

① 注意检查刀具，及时更换刀口，定期磨刀。

② 保持防卷板的清洁，每做一例冷冻切片，均应将刀口及防卷板拭擦干净，防止切片的污染和切片皱缩。

③ 调整刀、防卷板的位置，保证两者平行，且防卷板次刀锋前 0.2 mm 左右。

④ 句理组织应完全，没法切片者再滴加包埋胶。

2、组织块脱落对切片的影响

冷冻切片一般要求在 30 min 内发出病理报告，以便手术医生能尽快选择手术方式。

组织块脱落常见原因有：

冻头在冷冻机内放置时间过长，致使包埋胶还来不及渗到冻头的底部便凝固了，导致包埋胶与冻头粘连不紧，稍受外力的作用便脱落。