石蜡切片技术（组织学基本技术）

石蜡切片技术是利用石蜡替代组织内的水分，从而可制成切片，并良好地保存组织和细胞的结构。

器材：

仪器与材料 恒温干燥箱、石蜡切片机、展片盒、烤片机、拨针、标本瓶、标签纸、滤纸、镊子、刀片、量筒、漏斗、滴管、酒精灯、切片刀、小木块（或蜡块托）、蜡铲、载玻片、毛笔、切片盒、切片架、蜡杯、浸蜡盒、包埋盒。

试剂：

① 固定液。多采用 10％ 甲醛水溶液。取 10 ml 甲醛再加入蒸馏水 90 ml；

② 70％ 乙醇。取 95％ 乙醇 70 ml 再加入蒸馏水 25 ml；

③ 85％ 乙醇。取 95％ 乙醇 70 ml 再加入蒸馏水 10 ml；

④ 95％ 乙醇（原装）；

⑤ 100％ 乙醇（原装）；

⑥ 二甲苯（原装）；

⑦ 切片石蜡（熔点为 54～62 ℃）；

⑧ 蛋白甘油：取鸡蛋的蛋白加入等量的甘油搅拌混合，至均匀为止。加入约为 1％ 量的麝香草酚（一小粒），借以防止微生物的侵入和腐败。置冰箱备用。

1、取材与固定

根据不同的实验目的，选择相应的组织材料，及时投入盛有固定液体的标本瓶中。固定液的用量一般为材料的 10～15 倍或稍多，常规固定时间为 12～48 h。

2、打开恒温干燥箱调至 62 ℃（熔蜡）

（1）放入两个盛有适当熔点石蜡的蜡盒使蜡熔化，组编为（Ⅰ）号、（Ⅱ）号。

（2）放入盛有适当熔点石蜡的蜡杯使蜡熔化（包埋备用蜡）。

3、脱水与透明步骤

（1）倒出固定液。
（2）70％ 乙醇，1～2 h（根据组织块大小而定）。如不及时使用，可放入冰箱 4 ℃ 保存。如间隔时间较长，可在乙醇中加入适量甘油，再放入冰箱中保存。
（3）85％ 乙醇 1～2 h（根据组织块大小而定）。
（4）95％ 乙醇，为保持浓度稳定，中间更换一次同等液体，两次共 1～2 h（根据组织块大小而定）。
（5）100％ 乙醇，为保持浓度稳定，中间更换一次同等液体，两次共 1～2 h（根据组织块大小而定）。
（6）二甲苯，为保持浓度稳定，中间更换一次同等液体，两次共 40 min～2 h（根据组织块大小而定）。

4、浸蜡

透明的组织从二甲苯中取出，立即放入（Ⅰ）号蜡盒，0.5 h 后放入（Ⅱ）号蜡盒，一般为 1～1.5 h（根据组织块大小而定）。

5、包埋

将熔化蜡倒入包埋盒，用温镊子夹取组织块放入盒的中央位置，待石蜡全部凝结变硬即可取出。

6、修切蜡块

把包埋好的蜡块用刀片修切成正方形或长方形，注意勿太靠近组织，让组织四周留有少许石蜡，蜡块两边必须切成平行的直线，以免切下的蜡条弯曲。

7、固定蜡块

取小木块，用蜡铲在酒精灯上加热，使石蜡块底面熔化一层粘于小木块上，冷却后装在切片机上。

8、载玻片

取干净的载玻片涂以甘油蛋白：以玻璃棒尖端稍取甘油蛋白一滴，轻轻滴于载玻片中央，常以洗净的手指加涂布，涂布的面不宜太广，而以恰恰能够贴附蜡片为度。甘油蛋白不能涂布过多，否则，会形成白膜，妨碍观察。

9、切片

在开始切片前，先熟悉切片机的构造和用法，装上切片刀，注意刀倾角不宜过大，亦不宜过小，大致上以 20～30 ℃ 为宜。如倾角过大，则切片上卷，过小，则切片皱起。

10、贴片

蜡带受热即自动展开，也可用拨针轻轻拉开。待蜡片完全展平后，用滤纸吸去多余水分。注意切片和载玻片之间不能有气泡，否则在展片时气泡会扩大，甚至致使切片破损、变形，影响组织观察。

11、烤片

将贴片置入 37～62 ℃ 恒温干燥箱干燥 12 h。干燥后片子常温、阴凉处保存待实验时用。

1、组织要求新鲜，避免挤压，挫伤和干枯。固定时间根据组织块大小而定。

2、在 85％ 乙醇内组织可保留较久，如果当天来不及做完，可暂保存一晚，第二日再做。

3、组织放入二甲苯后，待组织块透明后，立即浸蜡，外曝露时间过长组织易干。

4、浸蜡以前，先做好准备工作，恒温干燥箱中分装在（I）号、（II）号蜡盒的石蜡应已完全熔化，保持恒定。

5、蜡片出现裂隙或碎裂可能与组织浸蜡不足，或浸蜡温度过高，或在透明剂中时间过久有关，组织易发脆。

6、蜡片厚薄不一可能与刀或蜡块未固定牢，切片机磨损发生故障有关。

7、蜡片卷起可能与刀口太钝或不清洁，刀的角度过大或石蜡过硬有关，试用手温或温水在蜡块上轻涂布一下。

8、蜡片易粘在切片刀上或蜡片皱缩可能与室温过高、刀的角度过小或石蜡太软有关，试用冰块冰一下即可。

9、蜡带弯曲可能与蜡块上下不平行，刀钝，蜡块不与刀刃平行有关。

10、切片注意事项：

a．调整刻度指针到要求的厚度，一般要求 5～8 μm，切片刀要拭净；

b．用右手摇切片机转轮，左手持毛笔托住蜡带，转动切片机时不可太快，用力宜均匀，不可时快时慢，防止机器振动太厉害，以致切片厚薄不均匀；

c．用毛笔托住蜡带，放在展片盒内（水温宜在 48 ℃ 左右）展片。