石蜡切片技术实验

实验目的

掌握动植物材料石蜡切片的方法及要求。

实验原理

见石蜡切片理论部分

实验材料

小白鼠各种器官组织

实验方法

• 石蜡切片技术（一）取材与固定

• 石蜡切片技术（二）渗透与包埋

• 石蜡切片技术（三）切片

• 石蜡切片技术（四）染色

• 石蜡切片技术（五）观察总结

一、取材与固定

1 准备工作：工具、药品、计划等

2 动物的麻醉：氯仿麻醉

3 解剖取材

4 材料分割：保持样品的完整性与代表性，考虑切片方向，实心组织大小undefinedundefined2mm,空心细长组织10mm长。

5 固定：布温氏固定液固定24h。

6 漂洗：70%乙醇换洗3次，每次20~60min。

7 保存：70%乙醇0~4 ℃ 。

二、脱水、渗透与包埋

1 脱水：85%乙醇→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇，每步30min~60min

2透明：1/2乙醇＋1/2二甲苯→二甲苯→二甲苯，每步30min~60min

3 渗透： 1/2二甲苯＋ ½石蜡→石蜡→石蜡，每步20min~60min，温度62℃

4 包埋：将材料放入盛有石蜡的纸盒中，摆好位置（要考虑下一步的修快与切片方向），在水中冷却5～10min.

三、切片

1 修块 用单面刀片在玻璃板上修快使达到以下要求：

（1）一个蜡块含一个材料，蜡块呈正方形或长方形，材料位于蜡块正中央。

（2）材料边缘与蜡块边缘平行，各面要平直，材料边缘与蜡块边缘的距离约3mm。

2 固着 将修好块的蜡块用烧热的解剖刀固着在样品台上。

3 切片 按以下顺序进行

（1）将样品台固定在切片机样品臂上，使切面竖直；

（2）调切片厚度5～10um；

（3）将切片刀用纱布蘸少许二甲苯擦净后装到切片机上，调刀角15～20，将刀固定好

（4）调刀距 使样品与刀口尽可能靠近；

（5）切片顺时针摇动切片机速度40-60r/min；

（6）将切好的蜡带光面向下用毛笔放到台纸上

4 贴片

(1)清洗载波片；

(2)加粘片剂，要求薄、匀；

(3)放切片，光面向下；

(4)加水于切片下面；

(5)展片将载波片放于50℃的温台上至切片完全展平；

(6)烤干吸掉多余水，继续放于温台上至水完全干燥；

5 贴标签 临时标签，用铅笔写明组号、姓名。

四、染色

1 脱蜡 二甲苯(2)→二甲苯(1)，每步510min；

2 复水 1/2乙醇+1/2二甲苯→100%乙醇(2)→ 100%乙醇(1)→ 85%乙醇→ 70%乙醇→ 50%乙醇→ 30%乙醇→
蒸馏 水,每步2min；

3 初染 代氏苏木精染色15min；

4 分化 0.1%HCl脱色至变红→0.1%NaOH至变蓝；

5 脱水 蒸馏 水（3－5s）→ 30%乙醇→ 50%乙醇→70%乙醇→ 85%乙醇,每步2min；

6 复染 0.5%伊红（溶于95%乙醇）染色10~15min；

7 脱水透明95%乙醇(1020s)→100%乙醇(1) →100%乙醇(2)→ 1/2乙醇+1/2二甲苯→二甲苯(1) →二甲苯(2)(≥3min),每步2~3min；

8 封片 将材料周围擦干净（注意在擦的过程中材料上的二甲苯必须保证不能干，可随时补加），加1～2滴中性树胶，加盖玻片（需提前洗净擦干备用）；

9 贴标签 注明样品名称、染色方法、组号、姓名和日期；

10 镜检 检查样品取材、切片及染色情况，熟悉样品为下次样品观察做好准备；

11 干燥 平放于展片盘中，于37℃温箱中或自然干燥；

12 预习 下次实验：样品的观察，需提前做好预习，并准备纸、铅笔。

五、观察

1 样品观察

• 小白鼠脑；

• 小白鼠心肌；

• 小白鼠肝脏；

• 小白鼠肾脏；

• 小白鼠肺；

• 小白鼠小肠；

• 小白鼠肌肉；

• 小白鼠精巢；

• 小白鼠卵巢等。

2 绘图

• 任选一种样品将结构完整地绘于实验报告上。

3 样品结构显微照片如下：