石蜡切片法

石蜡切片技术是显微技术上最重要最常用的一种方法。其优点在于①应用范围广，几乎适用于所有的植物材料；②能将材料切成厚薄均一的切片，较清楚地显现细胞、组织的细微结构；③能切成连续蜡带，可观察细胞和组织的动态发生及层次变化过程；④切片可以长期保存，便于以后观察比较。缺点是：操作程序比较复杂，需要时间较长，有些质地过硬的材料也不宜采用；另外，石蜡制片需要一定条件和设备。

石蜡切片法的整个过程较复杂，可大体概括为：取材-固定-脱水-透明-浸蜡-包埋-修块-切片-精片-脱蜡分染色-脱水-透明-封藏

石蜡制片程序如下：

1 材料采集、分割：采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料要有代表性和完整性，无病虫害及其他损伤。根据所采集材料的特征，依据不同的分割方法分割为适当的大小，分割大小一般不超过 0.5-1.5cm³。如果是子房、花药，就不需进行分割。

2 杀死与固定：采用一定的化学溶液（固定液）在尽可能保持细胞生活结构的情况下迅速杀死组织的过程。其作用有：①防止组织溶解及腐败；②使细胞内各种成分沉淀保存下来，保持其原有的生活结构；③便细胞内的成分产生不同的折射率，形成光学上的差异，便于观察；④使细胞硬化不容易变形，利于固定以后的处理。

固定时应根据材料的性质及制片目的选用合适的固定液，常用的固定剂有 F.A.A 、卡诺氏等固定液。要根据材料大小、多少掌握固定液的用量；某些含水量大的材料应多换儿次固定液，以保证固定液维持一定的浓废；若材料漂浮在固定液表面，则用注射针管或抽气机进行抽气处理或用其他机械处理办法抽去细胞间隙的空气，直至材料全部浸人固定液；另外，严格掌握固定的时间，要视材料的种类、性质、大小和固定液的种类而定；固定完毕的材料，若不能立即制片，可放于 70%酒精中存放。如用 F.A.A 固定液，固定 24h 后，材料仍可保存在固定液中备用。 `

3 脱水•脱水的目的是除去组织内多余的水分，使材料变硬，形状愈加稳定；利于材料的保存和下一步的透明、浸蜡等。常用的脱水剂为酒精，其原则是从低浓度逐级移入高浓度，否则会引起材料的强烈收缩而变形，即由 30%-50%-70%-85%-95%到无水酒精（两次），具体从哪一级酒精开始脱水，应依据固定液的性质而定。材料在各级酒精中处理的时间视材料大小和性质而定，通常每级停留 2-4h, 无水酒精每次停留 1.5-3h, 已切好的切片每级停留 3-20min 。

4 透明：透明的目的是除去脱水剂，使材料透明并增加折光系数；同时便于包埋剂（石蜡）进人组织中。最常用的透明剂为二甲苯，使用原则是也要逐渐进行，可减少材料收缩，即由 1/2 纯酒精十 1/2 二甲苯到二甲苯（两次），每级为 1-2h。二甲苯透明能力强但易于使组织收缩变脆，使用时不能在其中停留时间过长，同时脱水要干净。在 1/2纯酒精十 1/2 二甲苯混合液中时，可加入少许番红干粉，使材料若色，便于包埋在石蜡中后容易看见材料的位置，切片时易于辨别材料的方向。若材料放入 1/2 纯酒精+1/2二甲苯混合液中时溶液变混浊，说明材料中含有水分，材料脱水不彻底，应把材料逐步退回至无水酒精中再进行脱水。

5 浸蜡：浸蜡的目的是逐渐除去透明剂，并为包埋剂（石蜡）所代替，以便进行包埋。石蜡又是包埋剂，其熔点在 42-60℃之间。软的材料用 54-56℃熔点的石蜡，如果材料较硬，应选用熔点较高的石蜡；切片较薄时（在8μm以下）选用熔点较高的石蜡；气温较高时用熔点较高的石蜡，气温较低时用熔点较低的石蜡。石蜡必须纯净，不含杂质。浸蜡过程是使石蜡慢慢进人浸有透明剂的材料中，然后用石蜡完全代替透明剂进入材料组织中。浸蜡的力法如下：材料经二甲苯透明后，倒去一部分二甲苯，然后轻轻倒上已熔化的石蜡。倒入的石蜡即凝成固体，然后将装有材料的小瓶放在 35-37℃温箱中过夜，经 1-2 天直至石蜡不再继续熔化为止。调节温箱温度到 56-58℃左右，待石蜡完全熔化后倒去，换三次新鲜纯蜡，每次停留 2-5h, 使留在组织内的二甲苯全部被石蜡替代。

6 包埋：就是将已浸好蜡的材料连同熔化的石蜡一起倒入定形的纸盒中，并根据需要把材料按一定间距调整好位置，使之凝固，这样就把材料包埋在石蜡中，去掉纸盒后蜡块可长期保存各用。

7 整修与固着（图 1-2-3), 将已包埋好的蜡块，按需要切面（横切或纵切），把大蜡块裁成小蜡块，用单面刀片去掉材料四周多余的石蜡成为大小适当的方块，并修出切面，修好的蜡块各边要平行，否则切出的蜡带不会平直，然后用烧红的蜡铲把蜡块底部牢固的粘换在木质蜡座上，以避免切片时脱落。

8 切片（图 1-2-3), 用旋转切片机将蜡块切成连续蜡带，其厚度一般在 8-14μm之间。切片时，将材料夹在切片机的固定位置上，调整材料切面与切片刀口平行，根据观察的要求调节好所需要的切片厚度。切片过程中往往会出现各种问题，需要分析原因，及时纠正。

9 粘片与展片：在干净载玻片的中央滴一小滴蛋清甘油（或明胶甘油）粘片剂，以洗净的手指涂抹均匀，范围以足够粘贴蜡片为度，多余粘贴剂应抹去，在载玻片左侧用记号笔写上编号，并加数滴蒸馏水于载玻片中央，取镜检合格的蜡片，以光亮的一面向下平放于载玻片的水面上，随后将已放材料的玻片，平放在 35-40℃的展片台上，使蜡片展平（或在酒精灯上稍许加热）并摆好蜡片位置，去掉多余水分，放入摊片盘中，装滴一盘后移至恒温箱中 (38-40℃)继续烘干（常需 2-3d)备用。

10. 染色制片：切片贴好烘干后可进行染色制片。染色方法很多，根据制片目的而定。下面以植物制片中最常用的番红与固绿对染的方法为例，说明从脱蜡、染色至最后封藏的全部制片过程。

(1)脱蜡：先将二甲苯盛入染色缸中（容量为缸的 4/5), 将已烘干待脱蜡的玻片放入缸中 5-10min, 使石蜡完全溶解后，转入 1/2 二甲苯+1/2 纯酒精中 3-5min。

(2)复水：脱去蜡的切片经各级酒精到蒸馏水。即由无水酒精到95%-85%-70%-50%-30%各级酒精到蒸馏水，每级 1-2min 。

(3)番红染色： 0.5-1%番红水溶液中染色 2-24h 。

(4) 冲洗：用自来水轻轻洗去多余的染色液。

(5)脱水：依次用 30% 、 50% 、 70% 、 85% 的酒精处理，每级 1-2min 。

(6) 固绿染色用 0.1%的固绿的 95%酒精溶液复染 10-40, 。

(7) 透明、封藏：经 95%酒精到无水酒精（两次）到1/2无水酒精 +1/2 二甲苯到二甲苯（两次），每级 2-3min, 加拿大树胶封片。