植物石蜡切片技术

由于植物体积较大且不透明，无法直接在显微镜下观察。要研究植物的内部结构，必须减少样品的厚度及体积，使光线透过样品，这样才可用显微镜观察。通过各种制片方法处理样品后，样品不仅小而薄、完整、透明、保持原有结构，而且具有颜色，容易辨认和观察。石蜡切片法是显微技术上最重要、最常用的一种方法。它是以石蜡作为包埋剂，用旋转切片机将样品切成 8~12 pm 厚的连续切片。经一系列处理后，可制成永久存片。

全过程如下：

取样与固定一洗涤一脱水一清净一透蜡一包埋一切片一粘片一脱蜡一染色一脱水一透明一封固（图8-1）。

器材：刀片（双面刀片或剃刀）、滴管、毛笔、培养皿、载玻片、小酒盅、温箱、切片机、毛笔、载玻片、烤片台、染色缸。

试剂：

① 植物材料

② 固定剂（常用 FAA 或 FPA）

③ 各级乙醇（浓度根据样品而定）、二甲苯溶液、无水乙醇二甲苯混合液

④ 蒸馏水

⑤ 石蜡块

⑥ 粘贴剂

⑦ 番红与固绿染料

⑧ 加拿大树胶或中性树胶

植物石蜡切片技术的基本过程可分为如下几步：

—、取样与固定

选择新鲜、健壮、正常、有代表性的材料，分割成 0.5~1 cm³ 的小块或片，迅速投入到固定剂中固定。固定的目的是把组织或细胞迅速杀死，使其形态结构尽可能保持在接近生活时的状态。最常用的固定剂是 FAA 或 FPA［甲醛：丙酸：70% 乙醇 = 1：1：18，V/V］。对于含水较多的细嫩样品可用 50% 乙醇代替 70% 乙醇。固定剂的量一般为样品的 50 倍。固定时应将样品中的空气抽出，便于固定剂进入样品中。固定时间 2~24 h，也可在 FAA 固定剂中长期保存。

二、洗涤

固定结束后，用水或乙醇洗去残留在组织中的固定剂。用水溶液配制的固定液，一律用水洗。凡是用乙醇配制的固定液，一律用同浓度的乙醇清洗。洗涤时间一般为 1~2 h，期间更换洗涤剂 2 或 3 次。

三、脱水

材料经洗涤后，脱水时须由低浓度乙醇逐步向高浓度乙醇转换，以脱去样品中的水分，各级乙醇浓度为 30%、50%、70%、80%、90%、100% 乙醇，每级 1~2 h，时间长短视样品的大小而定。若暂时不能埋蜡，材料可放在 70% 乙醇中保存，经久不坏。

四、清净（透明）

由于材料脱水后，其中含乙醇，乙醇与石蜡不能混合，仍需除去。脱乙醇通常用二甲苯，材料由乙醇入二甲苯，最好也逐步进行，先经无水乙醇二甲苯混合液，再入纯二甲苯中，纯二甲苯需换 1 或 2 次，每次 30 min。

五、透蜡

取熔点为 52~56 ℃ 的石蜡，用解剖刀切成小块，将蜡块放入具有等量二甲苯的小酒盅内。然后把盛有材料的小酒盅放入 40 ℃ 的温箱中，经过 6~10 h，然后移入 60 ℃ 温箱中 1~2 h，在此过程中二甲苯逐渐蒸发，石蜡液变浓，然后倒去石蜡，倒入熔化的纯石蜡，经 2~4 h 再倒去石蜡，换新石蜡，再经 2~4 h 即可包埋。

六、包埋

先准备 1 把镊子、1 盆冷水、酒精灯及打火机，再按需要折几个包埋用的纸盒，纸盒是用较硬而光滑的纸折成，大小依材料而定。先将干净的石蜡倒入纸盒中，用烧烫的镶子将石蜡中的气泡很快赶去，并将石蜡烫均匀，接着把材料倒入，用热綴子将材料按需要的切面及一定的间隔（二者相隔 3~4 mm）排列整齐，要使整个材料放平（图 8-1）。材料放好后，轻轻吹气使石蜡表面凝结，然后把纸盒平放入冷水中（或冷板上），使石蜡尽快凝固，否则会使石蜡产生结晶，已结晶的石蜡就不能切片。制成的蜡块剥去纸盒，贴上标签，可以长期贮藏。

七、切片

分割蜡块，使每个小蜡块只具 1 个样品，然后将小蜡块修成正六面体，修块时要将最先被切到的部分留少许蜡，相反的一面蜡要多些，接着把小蜡块贴在木头块上，粘时先把小蜡块的一端涂上一层熔化的废蜡，然后把小蜡块留蜡较多的一头粘在木块上，再用解剖刀熔化少许废蜡在小蜡块四周，使其加固。在此过程中，尽量使材料的切面和刀口垂直。将粘好蜡块的木块夹在转动切片机的固定装置上，然后把钢刀（或刀片）安装在切片机上，调整木块的角度，使材料的切面与刀口平行。接着调整厚度控制器，拨到所需厚度，此时右手摇切片机，蜡块到刀口以后，切片就从刀口落下，由于切片过程中摩擦生热，切下的切片连成 1 条蜡带，此时左手拿 1 支毛笔将蜡带托住，并按次序将蜡片放在蜡带盘中。

八、粘片

切下的蜡带需要粘在载玻片上，在粘片以前必须把蜡带盖好，防止尘土入内，若尘土粘在切片上就会使以后制成的切片上结构模糊不清。粘片时将干净的载玻片中央滴少许粘贴剂，将此粘贴剂用手指在载玻片上涂均，然后在上面滴 1 滴 8% 甲醛水溶液或蒸俺水。用解剖刀把蜡带按所需大小切开，挑起放在载玻片上的水滴中，放置时注意蜡带有光滑和粗糙两面，把光滑一面向下与载玻片粘在一起。接着将浮有蜡带的载玻片放在烤片台上，蜡带受热展开，在此过程中用镶子把蜡带移至全载玻片 2/5 的位置土，用吸水纸吸去多余的水，让它干燥，或者放在 30~40 ℃ 的温箱中 1 天，使其干燥。

九、脱蜡

附有切片的载玻片烘干后，放入二甲苯中，在春秋季节需 5~10 min，石蜡熔去后，切片材料仍黏附在载玻片上，然后载玻片依次放入 1/2 无水乙醇 + 1/2 二甲苯、无水乙醇、95% 乙醇、85% 乙醇、70% 乙醇和水中。以上步骤均在染色缸中进行，每级约 1 min。

十、番红与固绿染色法

番红配成 1% 的水溶液，固绿配成 0.5% 的乙醇溶液（用 95% 的乙醇配制）。二甲苯脱蜡后，从高浓度到低浓度乙醇依次复水至蒸馏水后，用 1% 番红水溶液染色 1~2 h，蒸馏水洗涤后，从 35%、50%、75% 脱水至 85% 乙醇，固绿染色液染色 10~40 s，再依次用 95% 乙醇、无水乙醇 Ⅰ、无水乙醇 Ⅱ 过渡。脱水，经 1/2 无水乙醇 + 1/2 二甲苯过渡。

十一、脱水、透明、封固

经上述乙醇系列脱水，二甲苯透明后，用加拿大树胶或中性树胶封片。

1、固定的目的是把组织或细胞迅速杀死，使其形态结构尽可能保持在接近生活时的状态。最常用的固定剂是 FAA 或 FPA［甲醛：丙酸：70% 乙醇 = 1：1：18，V/V］。对于含水较多的细嫩样品可用 50% 乙醇代替 70% 乙醇。固定剂的量一般为样品的 50 倍。

2、材料置于高浓度乙醇中不能过久，因乙醇会使材料硬化，过久则材料由硬而脆，切片时易破碎。

3、二甲苯不仅脱去乙醇，并且对材料有透明作用，因此又称为透明剂。

4、放碎蜡块时应在材料和蜡之间隔一纸片，以免蜡和材料直接马上接触，造成材料收缩。

5、在切片分割蜡块过程中，尽量使材料的切面和刀口垂直。

6、在粘片以前必须把蜡带盖好，防止尘土入内，若尘土粘在切片上就会使以后制成的切片上结构模糊不清

7、染色石蜡切片的染色方法较多，可依研究目的进行选择。