石蜡切片与其他技术方法的结合

　　石蜡切片虽然是经典的方法，但又是最基本的方法，它与其他新的技术方法相结合，使传统的老技术扩大了其应用范围，开辟了许多新领域，增加了许多新的研究、观察内容。随新的 仪器 及新的研究技术的不断问世及使用，使组织学的观察研究从简单的形态结构深入到各种成分的定性观察，又从定性转向定量计测，使细胞组织的形态，功能及代谢三结合，从而达到定性可靠、定位准确及定量可测。

　　 与免疫学技术结合 组织制片技术与免疫学技术结合构成免疫组织（细胞）化学技术，利用抗原与抗体的特异性结合原理，检测组织切片中细胞组织的多肽及蛋白质等大分子物质的定性和定位观察研究。不论哪种免疫组织化学技术都包括抗体的制备、组织材料处理、制备玻片标本以及免疫染色。冰冻切片手续简便，制片过程中抗原活性丢失少，但组织细胞形态较差；石蜡切片步骤繁多，制片中抗原活性有所减低，但组织细胞形态清晰，是免疫组织化学常规制备切片方法之一。一般石蜡包埋的组织切片用于检测胞浆或核内的抗原，不宜做表面抗原染色，有人将新鲜组织浸泡于冷磷酸缓冲液内48小时，再固定于96％乙醇或其他固定液固定的组织切片，可用于表面抗原染色。乙醇、丙酮等固定剂对抗原破坏较轻，但结构保存较差。最常用的固定液有中性和缓冲福尔马林，它可与蛋白质交叉结合封闭抗原，在进行免疫染色前，切片再用蛋白酶消化，以暴露抗原部位、增强抗原的反应。在石蜡切片上进行的常用的免疫组化染色有免疫酶组织化学技术中的PAP法（非标记过氧化物酶-抗过氧化物酶法）及亲和免疫组织化学技术中的ABC法（抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物技术），其特异性强、敏感性高。使用两种染色法的组织切片都需先经第一抗体（各种抗血清）孵育；再经第二抗体或生物素标记的第二抗体孵育；后经PAP复和物或ABC复合物孵育，最后以DAB（二氨基联苯胺）-H2O2液显色呈棕黄色沉淀。常规复染、脱水、透明、封片成永久性玻片标本，光镜下检测常规或特殊染色法难以显示的成分及其精确定位，可用于基础研究及临床病理研究及诊断。微波用于石蜡包埋切片免疫组织化学染色既简化步骤又节省时间，且能促进免疫染色效果。

　　 石蜡包埋组织流式细胞仪DNA含量分析 是石蜡包埋组织切片与流式细胞术（flow cytometry，FCM）结合使用来测量DNA含量及倍体分析，这一结合是流式细胞仪在临床应用中，特别是在肿瘤研究方面开拓了新的研究途径。FCM是激光、电子和电子计算机、流体喷射技术的综合发展应用，是快速定量分析细胞的技术，要求被检细胞呈悬浮状态。目前已可测量细胞的大小、体积、DNA含量、DNA合成速率、RNA含量、表面抗原、染色体等。由于制备样品技术的原因，过去许多流式分析资料仅限于采用新鲜组织标本，Hedley等1983年首先报导了FCM分析石蜡包埋组织切片制备分散细胞悬液技术来进行DNA含量的检测，从组织切片中能获得足够数量的单个细胞，且与新鲜组织分离获得的单个细胞在形态及DNA含量组方图上均极为相似。目前国内也在逐步开展这方面的研究。由于这种方法取材可在病理组织观察或诊断基础上进行，比活检或手术切除标本更为准确，又可做回顾性研究分析；且对DNA检测速度快、数据客观可靠，在肿瘤诊断、预后的预测和治疗反应上具有重要价值；利用过去的标本可成批制作细胞悬液、成批上机测试，避免了 仪器 调试状态不同带来的影响，石蜡包埋块保存时间的长短对结果影响不大。

 

常规固定（多数用福尔马林）、石蜡包埋的组织块均可用于流式细胞术，但含苦味酸或汞的固定液均不宜使用。切片厚度以30～50微米为宜。切片脱蜡要干净、彻底，否则制备出的细胞悬液中碎片多，影响测定。梯度酒精水化后用胃蛋白酶或胰蛋白酶消化，消化后镜检呈单个分散状态；由于福尔马林固定可使DNA和核蛋白产生共价交联，影响DNA和染料的化学定量结合，导致荧光强度下降，蛋白酶可破坏其联结，改善测定的组方图质量，消化时间以能分散细胞及细胞碎片尽量少为适度，以100目尼龙筛网滤去未消化完的组织片，离心去上清液后，加入冰冷的70％酒精固定，放入4℃冰箱备用。上机前染色。DNA特异荧光染料主要有：（1）碘化丙锭（PI）；（2）溴化乙锭（EB）；（3） 4，6-二脒基-二苯基吲哚（DAPI）。FCM检测石蜡包埋组织细胞DNA含量可做为以形态学为基础，多参数综合诊断中的一个重要的新手段。由于仪器设备价格昂贵及制备样品的诸多环节均可能影响测定的数据，限制了临床的广泛使用。

　　 石蜡切片标本是形态计量技术的基础 形态计量技术是近年发展起来的一种新的定量检测技术，用全自动图像分析仪对组织和细胞内各种有形成分的数量、体积、长度及表面积等的图像数据进行数学处理，以便对 生物 组织细胞及其结构成分的形态进行定量分析，如线粒体个数、内质网、细胞核及胞质面积、胰岛的数量及各类细胞的数值、肾小体的数量和体积比以及Feulgen染色测定细胞核DNA原位定量等，使组织学及细胞学的研究由形态及定性观察转向形态定量化。形态计量是从石蜡组织切片或涂片以及组织的光镜照片和电镜照片上的各种结构获取二维图像数据，通过软件程序处理，得出有价值的结构参数。这种数据准确性高、客观性强、重复性好、可减少或弥补观察者的主观性差异。形态计量已应用于临床病理诊断工作，包括非肿瘤病变与肿瘤病变。国内对非肿瘤性病变的研究已涉及到动脉粥样硬化、肝硬变、前列腺肥大、克汀病、胰腺炎及精索静脉曲张等；而对肿瘤病变的研究则是形态计量学在临床研究的重点，目前较集中于消化道、肝、膀胱、乳腺和肺等器官的肿瘤。此外，在疾病的发生过程中把形态计量参数与功能变化指标有机地结合，有利于探讨疾病的发病机制；形态计量参数对肿瘤病变的治疗效果及预后判断的估计亦有参考价值。

在形态计量学的研究中，首先是对样品质量要求较高，例如制片过程中组织的收缩、膨胀与挤压、切片厚度与方向，特别是切片染色技术，染色是使组织或细胞各成分能染成不同色泽而便于识别，提高待测成分图像的可测性及其内在组分的表达性，使待测成分的色彩和亮度明显清晰地区别于它的背景。采用常规染色、特殊染色以及免疫组织化学染色，可对不同着色的成分及反应物作形态定量测定；利用免疫组织化学和原位杂交技术使病灶染色，再作形态定量测量。其次是要找出特征结构参数或定量指标，可先检测组织或细胞的各种可测参数或根据待测成分的形态特点设计一些参数，再用统计学方法筛选出有用的参数作定量测定。由于仪器昂贵，目前国内尚处在实验研究阶段，临床上的广泛应用尚有一定困难。形态计量技术与常规技术和其它新技术综合研究方法的使用，具有较好的应用价值及效果。

　　随着各种新仪器的问世和新技术方法的不断建立与使用，石蜡切片技术也逐渐扩展、渗入许多新领域中，做为基础技术提供有效的实验或使用样品。石蜡包埋组织切片还可用于细胞原位核酸分子杂交技术中，可对材料中被杂交的DNA分子进行定位、含量分析或观察基因表达（mRNA）水平； 聚合酶 链式反应（PCR）技术可用于固定、石蜡包埋组织的DNA分析，使研究进入了分子水平，但在短期内这些技术尚不能做常规使用。

 

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