石蜡切片操作

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一 材料的选择与分割

选取新鲜、无病虫害并具代表性的材料

先作徒手切片或剥离检查，决定适宜的材料，立即固定。

注意按季节和植物 生长发育不同阶段取材。

材料大小要适当;

例根：直径5mm以内----切取5-10mm小段

例叶：切成2-5mm

例茎：横切或纵切

例花：花药:横纵;子房：横纵

二 杀死、固定、保存

杀死：在制片过程中，将制片的材料迅速杀死，使组织块尽量保持原生活状态。这种处理叫杀生(死)。用一种或多种化学药品。

固定：在杀生处理过程中，将材料按原来的形态保存下来，并为后续制片保持固有形态，达到固定的要求。杀生、固定关系密切，通常二者兼有作用。

保存：组织块茎杀伤固定后，能较长时间保存下来，仍能制片。

常用固定液：

FAA固定液(福尔马林-冰醋酸-酒精)，万能固定液或标准保存液。

适用范围：根、茎、叶、花药、子房的组织切片均可

固定时间：一般24h， 并可在此液中长期保存。温度宜低(10度左右)

之后不必水洗，直接70%(嫩材料50%)酒精洗---进行脱水。

配法：福尔马林(38%甲醛)----5ml

冰醋酸-------------------------5ml

70%酒精-----------------------90ml (幼嫩材料50% 酒精防材料收缩)

用于胚胎材料改为：50% 酒精----89ml

甲醛------------5ml

冰醋酸---------6ml

~undefined可加入5ml甘油(丙三醇)放固定液蒸发和材料变硬。

Canoys Fluid(卡诺氏液)

适用范围：常用于细胞学如根尖，花药的压片，及子房石蜡切片

固定时间：不同。根尖、花药15min-半小时，花药1h，其他材料不超过24小时(12-24h)否则材料受到破坏。固定后用同浓度酒精洗涤。

保存液：70% 酒精(95%，85% 酒精浸洗约20 分---70%酒精中保存)

卡诺液配制：纯酒精(或95%酒精)：冰醋酸=3：1

三 脱水

制作石蜡切片，要把材料包埋在石蜡中，所以浸蜡前必须把材料中水分出去。有水分石蜡无法渗入到细胞中。

脱水：就是用一种药剂，把材料中水分全部代替干净。

其作用：

1 材料变硬，形状更稳定。

2 除尽水分，使包埋剂和封固剂渗透于组织中，包埋剂和封固剂不能与水混合，必须

把水除尽。

常用脱水剂：

酒精(不是最理想的，易引起组织收缩，使材料变硬。脱水后还要用其他有机溶剂除尽酒精。但应用久，价格低廉。)

注意：

1 脱水从低浓度开始逐渐替换高浓度酒精。否则发生细胞收缩。

2 从同浓度(保存液中)酒精开始。例FAA 从70% (50%)酒精开始。

3 30%---50%---70%----85%----95%(加少许番红，便于包埋中识别)---100%--100%。加盖，各级酒精停留时间因材料而定，材料2mm，各2-4h。

四 透明

脱水后要经过常用的有机溶剂(氯仿，二甲苯等)进行透明，便于石蜡及封固胶进入和溶合。当材料为透明剂所占，在显微镜下观察成透明状态。

常用的透明剂：二甲苯、氯仿、冬青油等。

二甲苯(xylol)是目前应用最广的透明剂，作用迅速，但易使材料变脆。盖盖!!

注意：使用时材料必脱尽水分，否则发生乳状混浊。

避免材料收缩----1/2 xyl + 1/2 alc (1h)-----xyl (1h)-----xyl (0.5 h)

五 浸蜡

以石蜡透入细胞组织内的全过程称为---浸蜡。其目的在于，除去材料中的二甲苯而代之以石蜡。

方法：

1 透明材料放小烧杯中，注新二甲苯漫过材料

2 加溶化的石蜡，由烧杯一侧慢慢倒入，与二甲苯等量

3 小烧杯放入蜡箱内(60℃)30-60min

4 换纯蜡，每次1-2h

六 包埋

选蜡：软材料---------------------------54-56℃熔点，(黄承芬p73)

5um以下厚度或夏季切片---58-60℃石蜡

叠纸盒

倒干净溶解的石蜡,半盒。

把材料放入，排列好，切面朝下(注意横切纵切)

赶气泡，放冷水中冷却。

七.切片

八.粘片和展片。

九.脱蜡：二甲苯

十.染色：苏木精、番红、固绿、碱性品红

单染 ：只用一种染料

双重染色：两种染料 番红--固绿; 苏木精---曙红

多重染色：多种染料 番红—固绿—桔红G;酸性品红—苯胺蓝—桔红G等