组织石蜡包埋和切片技术

包埋剂embedding agent

　　在制作切片或超薄切片时，由于组织是柔软的，或局部的软硬不均，这样制作厚薄均匀的切片是困难的。

所以有必要用一定物质浸透组织内部，整个组织一样硬化，以利于切成薄片，这种物质叫做包埋剂。一股用光学显微镜观察的切片，用石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等作包埋剂；电子显微镜则用环氧树脂、聚苯乙烯树脂、异丁烯树脂及水溶性树脂。

石蜡制片法是将材料经固定、脱水、透明、浸蜡后包埋在石蜡里面进行切片的方法。此法适用范围，制片手段完备，能将材料切成极薄的片子（可切至2-8微米左右），并能制成连续的片子，这是其它制片法难以达到的，因此在光学显微镜的制片技术上它是最常用的一种方法。

除了一些经不住石蜡切片法中所应用的各种药剂处理的材料不能应用石蜡切片以外，一般的材料都可以用此法制片，但有制作时间较长，操作过程复杂以及材料易发硬或发脆等缺点。该法多采用旋转式切片机进行切片。

石蜡制片操作程序如下：

（一）材料的采集与分割

采集材料应根据制片的目的和要求而定，材料要有代表性，无病虫害或其它损伤，如要观察病理解剖，则要取病斑、病症部位。采下的材料应立即放在标本箱或湿布包起来带回实验室进行分割固定（如有条件也可在试验地采集后进行分割固定）。

为使固定液能迅速的渗透材料，材料要进行分割。分割时动作要迅速，以防材料萎蔫。分割块的大小，宜小不宜大，一般不超过1cm3，分割后立即杀死固定。

（二）杀死与固定

利用药剂迅速把细胞杀死，以保持材料本来的状态和结构。

常用的固定有F.A.A固定液、卡诺固定液等。将固定液放在具塞小瓶中，投入材料，盖好瓶盖。用F.A.A固定液固定，时间至少24小时。

F.A.A固定液既是良好的固定剂，也是保存剂，因此材料可长期保存在固定液中备用。卡诺固定液穿透力强，固定较小材料一般1~6小时即可，最多不超过24小时。因卡诺固定液不能做保存剂，所以固定后要用95%、85%酒精浸洗，每级约20min.，然后保存在70%的酒精中备用。

（三）脱水

脱水的目的是除去组织中的水分，便于透明、浸蜡、包埋等步骤的进行，因为这些程序中所用的药品都不能与水混合，所以必须脱水。常用的脱水剂为酒精。脱水过程应缓慢进行，不能操之过急或时间过长，以免组织变硬变脆或发生收缩现象。

脱水采用等级脱水（系列脱水），即从较低浓度酒精开始，逐渐替换到高浓度酒精。一般为：50%→70%→80%→95%（此时可加少许番红，使组织着色便于包埋时定位）→无水酒精（两次），每级停留时间2~4小时或更长（无水酒精中时间宜短）。

用 95%酒精配制各浓度酒精的方法：设原有酒精浓度为A，所需配制酒精浓度为B，则取Bml原有酒精，加上A-Bml蒸馏水，即可获得Aml的B%的究竟。例如：95%酒精配成70%的酒精，则取70ml的95%酒精，加上25ml蒸馏水，则配成了95ml的70%的酒精。

（四）透明

透明的目的是将脱水剂从材料中除去，使材料透明，增记折光系数；同时便于下步的浸蜡和包埋等程序（因为究竟不能溶解石蜡）。透明剂是一种既能与脱水剂混合，又能与包埋剂混合的药剂。常用的透明剂为二甲苯和氯仿，适用原则也是逐级进行，可减少材料收缩。

一般步骤是：2/3纯酒精+1/3二甲苯→1/2纯酒精+1/2二甲苯→1/3纯酒精+2/3二甲苯→二甲苯（两次），每级停留时间0.5~2小时或更长些。二甲苯穿透能力强，但又宜使材料收缩变脆，使用时不能在其中停留时间过长。若材料放入二甲苯中时有白色混浊现象发生，说明材料脱水不彻底，应把材料退回至纯酒精中再行脱水。

（五）浸蜡

浸蜡的目的是逐渐除去透明剂,并为包埋剂所代替。常用的包埋剂是石蜡。浸蜡过程是使石蜡慢慢溶于浸有材料的透明剂中，溶解在透明剂中的石蜡渐渐深入到材料的细胞中去，最后使透明剂完全被石蜡取代，以便切片。

一般所用的石蜡分软蜡（熔点40℃ 以下）和硬蜡（熔点40℃以上）。浸蜡过程一般是从低温到高温、从低熔点到高熔点逐渐进行，这一过程不能操之过急，否则浸蜡不彻底影响切片。此外，软材料可用熔点较低石蜡，较硬的材料可用熔点较高的石蜡；冬季可用熔点较低的石蜡，夏季可用熔点较高的石蜡。

石蜡必须纯净，不含杂质。整个浸蜡过程需在恒温箱内进行（按需要调整温度）。材料最后一次二甲苯透明后即可浸蜡，浸蜡过程中逐渐使二甲苯挥发，并不断加入纯石蜡，直至石蜡饱和为止。浸蜡时间大约1~2天。

（六）包埋（埋蜡、沉床）

材料浸蜡后再换两次已熔融的纯蜡，然后将材料和石蜡一起倒入提前叠好的包埋纸盒中，用加热的镊子迅速将材料按一定的间隔和所需的切面摆放整齐，同时用加热的镊子赶走材料周围的气泡，待纸盒表面的石蜡凝固后将纸盒平放入冷水中，使石蜡迅速凝固。最后从纸盒中取出蜡块，以便保存。注意将样品编号封于蜡块上，以免样品混淆。

（七）修块

将已包埋好的蜡块切成小块，每一小块包含一块材料。然后按照所需的切面，用单面刀片将小蜡块切成梯形，并可粗视到材料切面。然后用烧红的蜡铲把蜡块底部牢固的粘接在载蜡器上。

（八）切片

用切片机（如旋转切片机）将蜡块切成连续的蜡带。切片时先把切片刀夹在刀架上，再把载蜡器夹在固定装置上（注意安装切刀的角度，刀口运行方向与材料切面平行），然后调整好所需厚度，一般可在7~14微米，视材料和所需观察对象而定，一般叶片、芽可厚些，胚囊和花粉粒可薄些，转动切片机切片。

（九）粘片

切下来的切片经过镜检（根据情况也可不检），将符合要求的切片粘在洁净的载玻片上。粘片时先在载玻片上滴上一小滴粘片剂（可用蛋青和甘油各50ml，加1g 水杨酸混合而成），加几滴蒸馏水，然后用镊子小心把切片放在水上，在35-40℃下，用拨针将切片伸直、展平，倾斜载片，使水流去并烘干。

（十）脱蜡、染色、脱水透明和封片

粘片后要经过脱蜡、染色、再次脱水透明，然后封片永久保存。下面以植物生物学中观察组织结构最常用的番红-固绿染色法说明脱蜡、染色、脱水透明和封片的过程：

二甲苯 →二甲苯（每次均10~15min.）→1/3纯酒精+2/3二甲苯（1~2min.）→1/2纯酒精+1/2二甲苯（1~2min.）→2/3纯酒精+1/3二甲苯（1~2min.）→纯酒精两次（每次1~2min.）→95%、85%、70%、50%梯度酒精复水（每级1~2min.或更长）→用 1%番红配50%酒精染色1小时→50%、70%、85%、95%梯度酒精脱水（每级1~2min.或更长）→用0.1%固绿配95%酒精复染2~5秒 →95%酒精脱水1~2分钟→纯酒精两次（每次1~2min.）→2/3纯酒精+1/3二甲苯透明（1~2min.）→1/2纯酒精+1/2二甲苯透明（1~2min.）→1/3纯酒精+2/3二甲苯透明（1~2min.）→二甲苯 →二甲苯（每次均10~15min.）→加拿大树胶封片→贴标签镜检及保存。

组织石蜡包埋和切片技术：

1、切取组织，浸泡在4％用pH7.4 BS配成的甲醛固定剂中，室温24小时。

附：4％甲醛固定剂（5ml）：4.5ml 1×PBS(pH7.4)+0.5ml甲醛

2、倒掉甲醛固定剂，加pH7.4 BS,每隔8小时更换一次，4℃保存，换液共3天。

3、打开烘箱，调温至62℃，融石蜡。

4、酒精梯度脱水（30％、50％、70％、80％、90％、95%、100％×2），隔30分钟更换一次。

5、50％酒精＋50％二甲苯30分钟（过渡步骤）。

6、100％二甲苯，时刻观察组织块至透明。

7、放入烘箱中已经预融的50％石蜡＋50％二甲苯中，30分钟。

8、100％石蜡两遍，每次2小时。(若石蜡浸润不够，仍有二甲苯，则包埋后的石蜡块较脆，易分层、断裂。)

9、100％石蜡纸盒内凝固（先用蜡打底，再放入组织块，浇上蜡包埋，放入4℃冰箱或水中冷凝，标明组织块放入方向），4℃存放备用。

10、修块。

11、融化石蜡抹于块底，贴在木块上，压实。

12、切片（5－10μm）,将切片平展于平板上，光面朝上。

13、将光面朝下，将石蜡薄切片放于水面上（水温40℃），使其伸展。（时间勿太长）。

14、将石蜡薄片贴在预先处理好的玻片上。

15、40℃烘烤过夜。

附：玻片的处理

切片前对洗净的载玻片用粘附剂进行处理是防止免疫组化过程中组织掉片的关键：洗净的载玻片于1:50丙酮稀释的APES中浸泡10～30s，取出后再放入纯丙酮中10～20s，涮去未与载玻片结合的APES，取出晾干备用。