材料与仪器
组织 胰蛋白酶
二甲苯 乙醇 生理盐水
尼龙网
二甲苯 乙醇 生理盐水
尼龙网
步骤
1. 把石蜡包埋组织切成 40~50 μm 厚的组织片 3~5 片，或用乳钵研成 0.5 mm 直径大小颗粒状，放入 10 ml 的试管中。
2. 加入二甲苯 5~8 ml 时，在室温下脱蜡 1~2 d，视石蜡脱净与否，更换 1~2 次二甲苯，石蜡脱净后，弃去二甲苯。
3. 水化：依次加入 100%、95%、70%、50% 梯度乙醇 5 ml，每步为 10 min，去乙醇，加入蒸馏水 3~5 ml，10 min 后弃之。
4. 消化：加入 2 ml 0.5% 胰蛋白酶 ( pH 1.5~2.0) 消化液，置 37℃ 恒温水浴中消化 30 min，在消化期间，每隔 10 min 用振荡器振荡 1 次。
5. 消化 30 min 后，立即加生理盐水终止消化。
6. 经 300 目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第 2 次消化。
7. 收集细胞悬液，离心沉淀 1500 r/min，再以生理盐水漂洗 1~2 次，离心沉淀 500~800 r/min，去碎片。
8. 保存细胞备用。
2. 加入二甲苯 5~8 ml 时，在室温下脱蜡 1~2 d，视石蜡脱净与否，更换 1~2 次二甲苯，石蜡脱净后，弃去二甲苯。
3. 水化：依次加入 100%、95%、70%、50% 梯度乙醇 5 ml，每步为 10 min，去乙醇，加入蒸馏水 3~5 ml，10 min 后弃之。
4. 消化：加入 2 ml 0.5% 胰蛋白酶 ( pH 1.5~2.0) 消化液，置 37℃ 恒温水浴中消化 30 min，在消化期间，每隔 10 min 用振荡器振荡 1 次。
5. 消化 30 min 后，立即加生理盐水终止消化。
6. 经 300 目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第 2 次消化。
7. 收集细胞悬液，离心沉淀 1500 r/min，再以生理盐水漂洗 1~2 次，离心沉淀 500~800 r/min，去碎片。
8. 保存细胞备用。
注意事项
1. 一定要将石蜡从组织中脱干净，一般脱蜡第 1 遍应在 12 h 左右，第 2 遍为 30 min 左右。检测是否将石蜡已脱净的方法是弃去二甲苯，加入无水乙醇，如果无絮状物浮起，即可视为蜡己脱净；反之，则蜡尚未脱净。
2. 消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞核被消化。
3. 切片不可过薄或过厚，过薄细胞碎片过多，影响分析结果；过厚造成脱蜡不理想。
4. 消化后的组织应先用眼科剪刀剪碎，然后再加胃蛋白酶消化，30 min，37℃，然后用尖吸管吹打成悬液状。
5. 消化后的组织悬液经过过滤后可能细胞数很少，这样就要将组织片放在 300 目尼龙网上，用底部圆滑的试管磨碎，再用 PBS 液冲洗一下；如此反复，就能得到较多的单细胞悬液。
2. 消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞核被消化。
3. 切片不可过薄或过厚，过薄细胞碎片过多，影响分析结果；过厚造成脱蜡不理想。
4. 消化后的组织应先用眼科剪刀剪碎，然后再加胃蛋白酶消化，30 min，37℃，然后用尖吸管吹打成悬液状。
5. 消化后的组织悬液经过过滤后可能细胞数很少，这样就要将组织片放在 300 目尼龙网上，用底部圆滑的试管磨碎，再用 PBS 液冲洗一下；如此反复，就能得到较多的单细胞悬液。
来源：丁香实验
