超薄切片技术

1 取材：用于固定的材料要求切割成 1mm3而大小的小块。太大固定液不易透入，造成材料内外固定不均；太小则材料受损伤的比率增高。取材时应注意：由于取材时要求切的组织块很小，组织受损伤的比例相当大，这无疑会引起细胞代谢的巨大变化，因此，切取后的组织应立即放人固定液中进行固定；植物体大多数部位的组织是由各种类型细胞组成的，因此在取材之前必须对材料所包含的细胞类型有比较清楚的了解。特别注意要使试验和对照的取材严格一致。

2 固定：通常采用戊二醛和锇酸双重固定法，具体步骤如下：

(1) 将材料切成约 1mm3的小块，立刻投人用 0.2 mol/L 磷酸缓冲液 (pH 值 7.3) 配制的 2.5%戊二醛固定液中，于室温下固定 2h 。

(2)倒去戊二醛固定液，材料用 0. 1mol/L 磷酸缓冲液冲洗 3 次，每次放置30min 。

(3)用 2%饿酸（以 0.2mol/L 磷酸缓冲液 (pH 7.3)稀释 4%的饿酸贮液而成］，在 4℃冰箱中固定 2-4h 。

(4)用磷酸缓冲液冲洗。

3 脱水：经戊二醛和锇酸双重固定并彻底清洗过的材料即可开始脱水。对常用的环氧树脂包埋剂而言，乙醇、丙酮、氧化丙烯作为脱水剂都是比较合适的。脱水要逐级进行，存 90%浓度之前，每级停留的时间可短些，到达 90%浓度之后要适当延长脱水时间。一般可按下列步骤进行： 30%丙酮 15min,50%丙酮 15min,70%丙酮15min,80%丙酮15min,90%丙酮 15 min,100%内酮 30min, 100%丙酮 30 min

4 渗透、包埋与聚合• 最常用的包埋剂是环氧树脂类，如 Epon812 、 ERL-4206 和Araldite, 它们的主要区别是黏度不同。包埋剂 Epon812 混合物可按下列配方配制：

前二种药物按顺序混合后搅拌均匀，然后边搅动边一滴滴加人 DMP-30, 每加一滴允分搅拌后冉加下一滴，－般要搅拌半小时以上 用环氧树脂作包埋剂时，整个渗透、包埋和聚合的操作步骤如下：

(1)植物材料转人丙酮：包埋剂 =3：1 的混合物中渗透 2h 。

(2)材料转入丙酮：包埋剂 =2：2 的混合物中渗透 2h 。

(3)材料转入丙酮：包埋剂 =1：3 的混合物中渗透 2h 。

(4) 材料转人纯包埋剂中过夜。

(5)将材料转入包埋板中，放好标签，注满纯包埋剂，放人 37℃温箱中过夜。

(6)将包埋板放入 60℃温箱中聚合 24-48h 。

5 切片：将修整好的标本块固定在切片机的样品忏内，然后将做好刀槽的玻璃刀装在刀架上，使样品块的长边在下，使刀成 4°-8°的间隙角，调整灯允位置，使成暗场照明，在双目显微镜下选拌刀口。锋利部分光缘极细，几乎看不到亮线出现，而刀口有缺陷的部分则因光缘散射出现明显亮线。选好刀口后，将蒸馏水注入刀槽内使液面水平，刀口润湿。将组织块对准所选用的刀口，先用粗调，后用细调使样品接近刀口。同时让样品作上下切割运动，直至切下切片，这时立即启开自动钮，开始干式切片。然后用具膜的铜网将厚度为 70 nm 以下的切片黏起，置于培养皿中的滤纸上干燥。

6 染色超薄切片的染色是通过某些重金属原子和细胞超微结构结合后，增加了细胞各组分对电子的散射能力，从而提高了标本的电子反差，使标本影像在电镜下看得更为清晰。超薄切片的常规染色方法是采用醋酸铀和柠檬酸铅的双染法。