四聚体染色技术

试剂与设备

1. 待检细胞：PBMC，脾细胞，淋巴结细胞或经过相应病毒感染细胞（注意其HLA-A型别）刺激形成的CTL细胞

2. FACS缓冲液（FB）：PBS+2%小牛血清+0.1%叠氮钠

3. 2 X HLA-I/抗原肽四聚体：2倍使用浓度的HLA-I/抗原肽四聚体

4. 1%多聚甲醛(PFA)的PBS

5. 离心机

6. 流式细胞分选仪

7. 加样器、吸头等

操作步骤

1. 将待检细胞悬浮于FACS缓冲液，浓度为5 X 107 细胞/ml。

2. 在微量滴定板中每孔加20μl细胞悬液。

3. 每孔加入20μl 2 X 四聚体试剂，吹打混匀，尽量避免气泡。

4. 在黑暗中冰浴1小时。

5. 加150μl FB，1200rpm离心5分钟。轻轻弹掉上清，也可以用抽吸的方法弃去上清，注意抽吸容易损失细胞，但是可避免有感染性或有害的样本造成污染。

6. 重复洗涤2次，方法同步骤5。

7. 用含1%多聚甲醛(PFA)的PBS 200μl 重悬细胞。PFA似乎可以增加一些“绿色”荧光标记的检出率。

8. 用FACS检测。

注意事项

1. 为了节省试剂，应设法使染色反应的体积尽可能小。通常加20μl的2X 四聚体试剂于20μl的2 X 细胞悬液，总体积为40μl。这仅作参考，可以根据实际情况调整反应体积。

2. 所有的染色反应都应在4℃进行。有时在室温下的染色强度更高。但有些表面标记对高温较敏感，特别是CD62L。

3. 在作较大规模实验时，应先测试剂的效价。上述制备的四聚体常用的最终稀释度为1:100。

4. 对于某些四聚体（但不是大多数），染色时可能观察到CD8介导的粘附，即四聚体结合到所有CD8+ 细胞上。这种CD8介导的粘附（暂且称其为非特异性粘附）能够通过加入CD8抗体阻断。

5. 对于新鲜淋巴细胞（PBMC，淋巴结，脾细胞），通常用1-2 X 106 细胞进行染色。对于细胞克隆和CTL细胞系，也许用2 X 105细胞也可能获得满意的染色效果。当对某个细胞克隆进行染色时，最好加入特异性不同的另一细胞克隆作为阴性对照。通常采用的比例为：特异性克隆:非特异性克隆=10:90。