四聚体的制备

经上述过程制备的生物素化的MHC/抗原肽复合物为单体分子，通过加入链酶亲和素，一个链酶亲和素分子有4个生物素结合位点，即可以结合4个生物素化的MHC单体分子，形成MHC四聚体。

【试剂及材料】

（1）荧光标记的链霉亲和素(通常用PE标记)

（2）经上述过程制备的生物素化的MHC单体

（3）加样器及吸头等

【操作步骤】

（1）计算样品中生物素化的MHC单体的摩尔数。建议生物素化的MHC单体浓度为2mg/ml，样品体积为100μl

（2）计算链霉亲和素中生物素结合位点的浓度。

（3）为了进行计算，必须知道PE-链霉亲和素偶联的浓度。计算亲和素的结合位点时，要注意PE标记的链酶亲和素的浓度是指链酶亲和素本身，还是指PE-链酶亲和素偶联物，并且要注意标记的PE与亲和素分子之间的比值。

例如，某种PE-链酶亲和素偶联物的浓度是1mg/ml，该浓度的计算依据是根据PE与链酶亲和素形成偶联物的质量，而不是依据单独链酶亲和素的质量。而且，该PE-亲和素偶联物中PE与亲和素的比值为1:1，1:1比值的PE-亲和素偶联物的分子量为300，000Da。

每一个亲和素分子具有4个生物素结合位点，所以该PE-链酶亲和素产品中生物素结合位点的浓度应根据下式计算：

(1mg/ml)X(1g/1000mg)X(1000ml/l)X(1mol/3000000g)×(4 生物素结合位点/mol)=1.33 X 10-5 mol/l

计算结果即每微升（μl）该链霉亲和素产品中生物素结合位点的浓度为1.33 X 10-11 mol。

（4）计算要加入的链霉亲和素的体积。计算时注意生物素化的MHC单体与亲和素中生物素结合位点的摩尔数要相等。举例来说：当生物素化的MHC单体为200μg时，要加入的APC标记的链霉亲和素的体积为174μl。

（5）将需要加入的链霉亲和素分10次缓慢地加入生物素化的MHC单体中，每加一次后，等待10-15分钟。这一过程在室温下进行，且应在黑暗中进行。

（6）将四聚体置于一个聚苯乙烯管，放进有盖的盒子中，于4 o C保存。以该法制备的四聚体可用3-6月。

【注意事项】

（1）MHC四聚体制备过程中，通常采用流式细胞分选仪能够识别的荧光标记物，其优点是能够买到带有这些荧光标记物的链酶亲和素，省去了对MHC/抗原肽复合物进行标记的麻烦。荧光标记物的选用取决于该标记物的标记效果（信噪比）、流式细胞分选仪要求的荧光标记物类型、可以利用的荧光抗体等。

用PE或APC（别藻蓝蛋白）标记MHC四聚体通常能够得到很好的标记效果，但使用APC的缺点是有些型号的流式细胞分选仪不能检测APC，所以MHC四聚体的荧光标记物常用PE。

（2）含有生物素化的MHC单体、链酶亲和素和MHC四聚体的溶液注避光保存。

（3）将PE-链酶亲和素偶联物加入生物素化的MHC单体中时，要按照上述操作步骤（5）进行。当加入亲和素过量时，这样能够避免对MHC四聚体形成的影响，因为开始加入的亲和素上的生物素结合位点会全部与生物素化MHC单体结合，形成MHC四聚体。所以少量多次加入亲和素有利于形成最大浓度的MHC四聚体。