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Feulgen 染色法(组织学基本技术)

相关实验:组织学基本技术

最新修订时间:

简介

Feulgen 染色技术是显示 DNA 定量测定的主要染色方法之一。

原理

Feulgen 染色技术的基本原理是标本通过 60 ℃ 的 1mol/L HCl 水解作用,可将 DNA 分子中嘌呤碱基与去氧核糖之间的糖苷键打开,所形成的醛基具有还原作用,它再与无色品红结合形成紫红色化合物,从而显示出 DNA 的分布。

材料与仪器

器材:恒温水浴箱、染缸、石蜡切片。

试剂:

① Carnoy 固定液(纯乙醇 60 ml,加氯仿 30 ml,加冰醋酸 10 ml)

② Schiff 试剂(15 ml 1 mol/L HC1 加 0.5 g 碱性品红,摇动使之溶解(不加温),加 0.6% 偏重亚硫酸钠(钾)85 ml,棕色瓶中密封,或黑纸包好,室温避光 24 h。第二天观察,溶液呈淡淡的草黄色,再加 300 mg 活性炭,摇 1 min,过滤后呈无色的 Schiff 试剂溶液。)

③ 1 mol/L HC1

④ 碱性品红

⑤ 偏重亚硫酸钠(钾)(先配 10% 的亚硫酸钠溶液,取 10 ml,加 200 ml 蒸馏水,再加 10 ml 1 mol/L HC1,摇匀)

⑥亚硫酸钠

⑦ 固绿染色液

⑧ 梯度乙醇

⑨ 二甲苯

⑩ 蒸馏水

⑪ 中性树胶

步骤

Feulgen 染色技术的基本过程可分为如下几步:

A. 先将恒温水浴箱达到 60 ℃ 恒温。

B. 烤干后石蜡切片经两道二甲苯将石蜡脱去。共约 40 min,以脱净石蜡为准。

C. 用两道无水乙醇将二甲苯洗去。共约 6 min。

D. 经 95%、90%、80% 及 70% 乙醇脱水。每道 2 min。

E. 蒸馏水。

F. 蒸馏水 60 ℃ 1 min(染缸应提前 10 min 放在恒温水浴箱预温)。

G. 1 mol/L HC1 60 ℃ 8~10 min(染缸应提前 10 min 放在恒温水浴箱预温)。

H. 1 mol/L HC1(室温)1 min。

I. Schiff 试剂 1 h。

J. 偏重亚硫酸钠洗液洗三次。

K. 自来水→蒸馏水。

L. 固绿染色液 1~2 min(可省略)。

M. 蒸馏水。

N. 95% 乙醇、无水乙醇各两道,每道 2 min。

O. 二甲苯两道,每道 20 min。
P. 中性树胶。
注意事项:切片不经过 60 ℃ 蒸馏水和 60 ℃ 1 mol/L HC1,直接进入室温的 1 mol/L HC 18~10 min。

注意事项

1. 1 mol/L HC1、60℃ 下水解时间要适当。如水解时间不够,反应会变弱;如水解时间过长,则脱氧核糖也易脱掉,反应也会减弱。水解时间长短要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。
2. Feulgen 反应成功与否的一个非常关键的因素是 Schiff 试剂的质量。Schiff 试剂的配制方法有误直接影响 DNA 的染色反应。
3. 因 Carnoy 固定固定一般 6 h 左右,如白天取材标本需经 95% 乙醇 4 ℃ 过夜。
4. 实验要设对照组,以便验证实验反应的结果。

来源:丁香实验

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