原理
材料与仪器
灭菌培养基 过柱缓冲液 FcR阻断剂 CD34微球
柱子(MS+ RS+或LS+ VS+) 磁珠细胞分离仪 尼龙过滤网 30μm
步骤
(a)准备过柱缓冲液,用抽真空装置去除气体。
(b)每108个CB-MNCs用终体积300μL缓冲液重悬。
(c)每108个CB-MNCs悬液加100μL FcR阻断剂,抑制CD34微珠非特异性结合或通过Fc受体介导与非靶细胞的结合。
(d)每108个CB-MNCs悬液加100μL CD34微球进行细胞标记,充分混匀后在6〜12℃冰箱放置30min。
(e)加PBSA洗,室温200g离心10min;加适量的缓冲液重选细胞。
(f)根据CB-MNCs的细胞总数选择合适的柱子类型(MS+/RS+或LS+/VS+),将柱子放人MACs分离仪的磁场中。加人缓冲液润洗柱子(MS+/RS+:50μL;LS+/VS:3mL)。
(g)用30μm的尼龙过滤网过滤细胞,去除细胞团。使用前,用缓冲液湿润柱子。
(h)将细胞悬液加人柱子,使未结合的细胞通过柱子。
(i)用缓冲液将未结合的细胞洗去(MS+/RS+:3×500μL;LS+/VS:3×3mL)。
(j)洗脱结合的细胞。将柱子从分离仪中移出。置于合适的管中。将柱子加满缓冲液(MS+/RS+:1mL;LS+/VS: 5mL)。用柱子随带的内塞,加压将结合的细胞冲洗出来。
(k)加PBSA将CD34+细胞洗一遍,室温200g离心l0min。用适当的培养基重悬细胞。
来源:丁香实验