从单个核细胞中分离T细胞

从单个核细胞中分离T细胞

一、用玫瑰花结形成试验分离E＋细胞

1．制备AET-绵羊红细胞

1）在刻度离心管中，用无菌的含5％小牛血清的Hanks液洗涤绵羊红细胞3次，每次离心500×g 10分钟。

2）吸净上清液，测量红细胞比容。轻击试管分散红细胞，加入4倍红细胞比容量、新鲜制备的AET溶液，混匀。室温中反应30分钟。

3）用无菌的含5％小牛血清的Hanks液洗涤AET-绵羊红细胞5次，每次离心500×g，10分钟。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞悬浮至10％（v/v）浓度。10％ AET-绵羊红细胞悬液可在4℃保存三周。

2．用玫瑰花结形成试验分离E＋细胞（Ficoll分离法）

1）用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将单个核细胞悬浮至107/ml，加入1/10~1/20量的10％ AET-绵羊红细胞悬液。混合后，室温放置1小时。离心500×g 10分钟，4℃过夜。

2）吸去上清液，用手轻轻旋转离心管，使细胞悬浮，不要用吸管吹打。加入同样培养液至原容量。

3）将细胞悬液小心加在半量淋巴细胞分离液上，室温中水平离心500×g 20分钟。

4）吸弃上层无细胞液体，将细胞培养液和淋巴细胞分离液交界面的细胞和约85％的淋巴细胞分离液吸出，置另一离心管中。交界面的即E－细胞，立即向该细胞悬液中加等量洗涤液，离心500×g 10分钟，去上清液；再用洗涤液同样洗涤2次，除去淋巴细胞分离液，以备进一步分离B淋巴细胞和单核细胞。

5）分离E＋细胞：吸出剩余液体，用10倍量Gey’s液悬浮沉淀细胞1～2分钟，低渗溶解红细胞。立即加入同量两倍浓缩的PBS，恢复等渗。离心500×g 10分钟，去上清液。再用RPMI-1640培养液同样洗涤2次。此即E＋细胞。用1％台盼蓝染色法测定细胞浓度和细胞活力，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞悬浮至适当浓度。

3．用玫瑰花结形成试验分离E＋细胞（Percoll分离法）

制备Percoll密度梯度

1）将1份10倍浓缩的PBS与9份Percoll混合，得到等渗的Percoll溶液，比重应是1.127。

2）稀释液（含25mmol/L Hepes, 10%小牛血清的RPMI-1640培养液）的比重约1.008左右。按下式配制不同比重的Percoll溶液： ％ Percoll＝（所需比重－稀释液比重）/（等渗Percoll溶液比重－稀释液比重）×100

分离E＋细胞

1）取10ml 5×106/ml的单个核细胞置离心管中，加2.5ml 10％ AET-绵羊红细胞和1ml小牛血清，混合后，20℃离心200×g 15分钟，确定没有悬浮的红细胞，冰浴60分钟或过夜。

2）轻轻旋转离心管，使细胞悬浮。注意不要用吸管吹打，吹打会打散一些玫瑰花结。将细胞悬液小心加在7～8ml Percoll溶液上，室温中水平离心500×g 20分钟。

3）吸弃上层无细胞液体，将交界面的细胞和约85％的Percoll溶液吸出，置另一离心管中。此即E－细胞，应立即用RPMI-1640培养液洗去Percoll。

4）收集E＋细胞：尽量吸弃红细胞上的Percoll溶液，用5ml Gey’s液悬浮细胞1～2分钟，溶解红细胞。立即将加入同量两倍浓缩的PBS，恢复等渗，离心500×g 10分钟，去上清液。再用RPMI-1640培养液同样洗涤2此。

5）分别用RPMI-1640培养液悬浮E＋和E－细胞，计数细胞。用荧光标记的抗体测定制剂中的B细胞、T细胞和单核细胞百分比。

二、用尼龙毛分析T细胞

尼龙毛柱的制备（注意无菌操作）

1.取直径3D，长度约10cm的尼龙毛，用0.2mol/L HCl浸泡处理过夜。用双蒸水洗净HCl，置37℃烘干备用。

2.称取50mg尼龙毛，均匀分散后置Hanks液中浸泡。取1ml注射器，出口接塑料管并夹住。将尼龙毛均匀填塞入注射器中，排净空气，柱高约5～6cm。此柱可分离约2×107细胞。将柱置－20℃可保存2～3个月。

分离细胞

1.取PBMC，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成2×107/0.5ml。

2.融化冻存的尼龙毛柱，以每分钟5～7滴的速度放出Hanks液。用5ml预温至37℃的细胞培养液洗涤尼龙毛柱。将0.5ml上述PBMC悬液加入尼龙毛柱中，待细胞悬液全部进入尼龙毛柱后，立即加0.2ml细胞培养液，夹住塑料管。

3.在37℃ 5％ CO2饱和水汽二氧化碳培养箱中培养1小时，使细胞与尼龙毛充分粘附。用5ml预温至37℃的细胞培养液洗脱尼龙毛柱。洗脱液中含有纯的T细胞。1000×g离心洗脱液10分钟，去上清液。再用细胞培养液洗涤细胞1次。计数细胞，用细胞培养液将细胞配成适当浓度。

三、用免疫磁珠法分离T细胞

将特异性抗T细胞单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠（immunomangnetic beads），用这种免疫磁珠从PBMC中结合T细胞。在磁场中，结合T细胞的免疫磁珠固定了，未结合的B细胞和其它细胞被洗脱下来。再从免疫磁珠上洗脱T细胞。