从单个核细胞中分离出T细胞

1）用玫瑰花结形成试验分离E＋细胞
1．制备AET-绵羊红细胞
1）在刻度离心管中，用无菌的含5％小牛血清的Hanks液洗涤绵羊红细胞3次，每次离心500×g 10分钟。
2）吸净上清液，测量红细胞比容。轻击试管分散红细胞，加入4倍红细胞比容量、新鲜制备的AET溶液，混匀。室温中反应30分钟。
3）用无菌的含5％小牛血清的Hanks液洗涤AET-绵羊红细胞5次，每次离心500×g，10分钟。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞悬浮至10％（v/v）浓度。10％ AET-绵羊红细胞悬液可在4℃保存三周。
2．用玫瑰花结形成试验分离E＋细胞（Ficoll分离法）
1）用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将单个核细胞悬浮至107/ml，加入1/10~1/20量的10％ AET-绵羊红细胞悬液。混合后，室温放置1小时。离心500×g 10分钟，4℃过夜。
2）吸去上清液，用手轻轻旋转离心管，使细胞悬浮，不要用吸管吹打。加入同样培养液至原容量。
3）将细胞悬液小心加在半量淋巴细胞分离液上，室温中水平离心500×g 20分钟。
4）吸弃上层无细胞液体，将 细胞培养 液和淋巴细胞分离液交界面的细胞和约85％的淋巴细胞分离液吸出，置另一离心管中。交界面的即E－细胞，立即向该细胞悬液中加等量洗涤液，离心500×g 10分钟，去上清液；再用洗涤液同样洗涤2次，除去淋巴细胞分离液，以备进一步分离B淋巴细胞和单核细胞。

5）分离E＋细胞：吸出剩余液体，用10倍量Gey’s液悬浮沉淀细胞1～2分钟，低渗溶解红细胞。立即加入同量两倍浓缩的PBS，恢复等渗。离心500×g 10分钟，去上清液。再用RPMI-1640培养液同样洗涤2次。此即E＋细胞。用1％台盼蓝染色法测定细胞浓度和细胞活力，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞悬浮至适当浓度。
3．用玫瑰花结形成试验分离E＋细胞（Percoll分离法）
制备Percoll密度梯度
1）将1份10倍浓缩的PBS与9份Percoll混合，得到等渗的Percoll溶液，比重应是1.127。
2）稀释液（含25mmol/L Hepes, 10%小牛血清的RPMI-1640培养液）的比重约1.008左右。按下式配制不同比重的Percoll溶液： ％ Percoll＝（所需比重－稀释液比重）/（等渗Percoll溶液比重－稀释液比重）×100
分离E＋细胞
1）取10ml 5×106/ml的单个核细胞置离心管中，加2.5ml 10％ AET-绵羊红细胞和1ml小牛血清，混合后，20℃离心200×g 15分钟，确定没有悬浮的红细胞，冰浴60分钟或过夜。