求助：人外周血单个核细胞分离、冻存的问题。

细胞分离

外周血用电动助吸器按照每管不多于35ml。平均分至50ml离心管中， 931×g，离心8min，吸取上层血浆至50ml 离心管中，取1 5 m l于E P管中。标记。 -80℃保存。用NA稀释血细胞，使得血细胞:NA为1、 1，混匀后均匀缓慢地加至相应的A液上层。形成完整的界面。 596×g。离心20min。可见明显分层。吸弃第1层上清。小心轻柔地将第2层的白色细胞层分别吸至不同的洁净50ml离心管中。分别向各管中加NA、稀释混匀。定容至40ml/管。 931×g。离心8min。吸弃上清，加NA重悬细胞。冻存处理前留取细胞悬液计数和活力测定。

细胞冷冻保存

纯化后细胞重悬于含终浓度9 8%的等体积DMSO2ml和右旋糖苷的冷冻保存液中，冷冻保护液配置成2组(1组含80%的无血清培养液，另1组含80%自体血浆)轻轻混匀后置-20℃冰箱冷却平衡5-15min到4℃以下。同时把冻存管放4℃冰箱平衡15min。分装入2ml冻存管内。每管1ml。管壁做好标识。放在样本冻存盒，转移至程序降温盒仪器。最终将细胞保存于-196℃液氮。

白膜层会有少量红细胞，不过经过冻存后红细胞会破碎溶解，应该不会影响单个核细胞的。

会一些红细胞残留，不用特别处理

红细胞一般死掉的可能性大呀，存活不太好。