简介
免疫细胞分离技术正向着越来越「精细」的方向发展，免疫细胞亚群乃至微量免疫细胞分离和鉴定技术也已成熟并在实验室得到应用，如通过免疫磁珠可以获得大量高度纯化的各种免疫细胞亚群，通过流式细胞仪可以分选到表达特定抗原的免疫细胞群体。当然，某些常规免疫细胞分离方法，如通过密度梯度离心分离外周血单个核细胞等技术也非常简便和实用，仍被广泛应用，目前更多地用于免疫磁珠分选或者流式细胞仪分选之前的准备和细胞富集。总之，可供选择的免疫细胞分离技术较多，但重要的是要根据研究所需免疫细胞的自身特点、研究内容的要求以及所在实验室的条件，选择最切合实际的免疫细胞分离方法。
原理
外周血单个核细胞分离的基本原理是根据其细胞密度（1.075～1.090）与其他细胞（红细胞和中性粒细胞密度为 1.090，血小板为 1.030～1.035）不同的特点，采用密度介于 1.075～1.092 之间而近于等渗的溶液（分层液）进行密度梯度离心，使不同密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将单个核细胞分离出来。
材料与仪器
试剂：
1．无菌肝素液 无菌生理盐水配制的含 125～250 IU/ml 肝素抗凝液，4 ℃ 保存备用。
2．淋巴细胞分层液（Ficoll-Hypaque，密度 1.077 g/L ± 0.001 g/L)。
3．Hanks 平衡液或生理盐水或 PBS，pH7.2～7.4，4 ℃ 避光保存备用。
4．RPMI 1640，含有 10% 胎牛血清的完全培养液。
5．15 ml 或 50 ml 聚丙烯锥形离心管。
6．锥虫蓝染液。
仪器：
低温离心机、无菌滴管、吸管、血细胞计数器、倒置显微镜及超净台等。
步骤
外周血单个核细胞分离的基本过程可分为以下几步：
1．无菌采集新鲜血液，用肝素抗凝（每毫升血液加入 0.1 ml 肝素液），若血量大，可先离心，室温 2000 r/min 或 400 g，20 分钟，取上层血浆及红细胞交界面的白细胞。
2．用等体积 PBS 或 Hanks 液稀释全血或富含白细胞的血液。
3．取等体积淋巴细胞分层液加入 15 ml 锥形离心管，升至室温（18～25℃）。
4．将离心管倾斜 45° 角，用玻璃吸管吸取稀释后的血液样品，在分层液面上 1 cm 处沿着管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上面，注意勿打乱液层界面。
5．配平后置于水平离心机，在室温（最适温度为 18～20 ℃），2000 r/min 或 400 g 离心 20 分钟，存放 2 小时以上的血液应离心 30 分钟。
6．将离心管平稳取出，离心后最下层是红细胞和粒细胞，中间层是分层液，最上层是血浆、稀释液等。血浆层与分层液交界处为一混浊的灰白色层，富含单个核细胞（包括淋巴细胞和单个核细胞）。
7．用毛细吸管轻轻插入到单个核细胞层，沿着管壁吸取该层，放入另一已预先盛有 10 ml 生理盐水或 Hanks 液或 RPMI 1640 完全培养液的试管中。也可先将上层血浆以及稀释液吸弃，换毛细吸管吸取该层细胞人另一试管中。
8．将所获得的稀释单个核细胞，在室温，1500 r/min 或 250 g 离心 10 分钟，弃上清。重复洗涤 1～2 次，除去血小板、分离介质和抗凝物质。
9．通过锥虫蓝染色检查细胞活力后，计数细胞，根据需要用 PBS 或合适的培养基将细胞稀释备用。
注意事项
1．一般每毫升健康成人血可分离获得 1 x 106～2 x 106 单个核细胞。该法分离的活细胞应在 95% 以上。
2．操作流程 2 中，等体积稀释血液可降低红细胞的凝聚，提高淋巴细胞收获量，该步骤也可省略。
3．为保持淋巴细胞的活性，应该采血后尽快分离细胞。
4．本操作流程也适用于分离组织中的单个核细胞，对于未经抗凝处理的血液，可先用链激酶溶解血凝块，然后分离。
5．小动物（如小鼠等）可从眼眶取血或断头取血，抗凝，用 PBS 1:1 稀释血液以增加回收率。
6．很多研究需要应用小鼠脾脏、胸腺、淋巴结来源的单个核细胞，对于这类细胞，常规方法是制备小鼠脾脏、胸腺、淋巴结的单细胞悬液，用红细胞裂解液溶解其中的红细胞，洗弃裂解液后获得的细胞再经过 Ficoll-Hypaque 分层液进行密度梯度离心可去除其中的细胞和剩余的红细胞。即可制备不同来源的小鼠单个核细胞。
来源：丁香实验
