从单个核细胞中分离T细胞

从单个核细胞中分离 T 细胞

 

1 ）用玫瑰花结形成试验分离 E ^＋ 细胞

 

1． 制备 AET- 绵羊红细胞

1） 在刻度离心管中，用无菌的含 5 ％小牛血清的 Hanks 液洗涤绵羊红细胞 3 次，每次离心 500 × g 10 分钟。

2） 吸净上清液，测量红细胞比容。轻击试管分散红细胞，加入 4 倍红细胞比容量、新鲜制备的 AET 溶液，混匀。室温中反应 30 分钟。

3） 用无菌的含 5 ％小牛血清的 Hanks 液洗涤 AET- 绵羊红细胞 5 次，每次离心 500 × g ， 10 分钟。用含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培养液将细胞悬浮至 10 ％（ v/v ）浓度。 10 ％ AET- 绵羊红细胞悬液可在 4 ℃保存三周。

2． 用玫瑰花结形成试验分离 E ^＋ 细胞（ Ficoll 分离法）

1） 用含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培养液将单个核细胞悬浮至 10⁷ /ml ，加入 1/10~1/20 量的 10 ％ AET- 绵羊红细胞悬液。混合后，室温放置 1 小时。离心 500 × g 10 分钟， 4 ℃过夜。

2） 吸去上清液，用手轻轻旋转离心管，使细胞悬浮，不要用吸管吹打。加入同样培养液至原容量。

3） 将细胞悬液小心加在半量淋巴细胞分离液上，室温中水平离心 500 × g 20 分钟。

4） 吸弃上层无细胞液体，将细胞培养液和淋巴细胞分离液交界面的细胞和约 85 ％的淋巴细胞分离液吸出，置另一离心管中。交界面的即 E ^－ 细胞，立即向该细胞悬液中加等量洗涤液，离心 500 × g 10 分钟，去上清液；再用洗涤液同样洗涤 2 次，除去淋巴细胞分离液，以备进一步分离 B 淋巴细胞和单核细胞。

5） 分离 E ^＋ 细胞：吸出剩余液体，用 10 倍量 Gey’s 液悬浮沉淀细胞 1 ～ 2 分钟，低渗溶解红细胞。立即加入同量两倍浓缩的 PBS ，恢复等渗。离心 500 × g 10 分钟，去上清液。再用 RPMI-1640 培养液同样洗涤 2 次。此即 E ^＋ 细胞。用 1 ％台盼蓝染色法测定细胞浓度和细胞活力，用含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培养液将细胞悬浮至适当浓度。

3． 用玫瑰花结形成试验分离 E ^＋ 细胞（ Percoll 分离法）

制备 Percoll 密度梯度

1） 将 1 份 10 倍浓缩的 PBS 与 9 份 Percoll 混合，得到等渗的 Percoll 溶液，比重应是 1.127 。

2） 稀释液（含 25mmol/L Hepes, 10% 小牛血清的 RPMI-1640 培养液）的比重约 1.008 左右。按下式配制不同比重的 Percoll 溶液： ％ Percoll ＝（所需比重－稀释液比重） / （等渗 Percoll 溶液比重－稀释液比重）× 100

分离 E ^＋ 细胞

1） 取 10ml 5 × 10⁶ /ml 的单个核细胞置离心管中，加 2.5ml 10 ％ AET- 绵羊红细胞和 1ml 小牛血清，混合后， 20 ℃离心 200 × g 15 分钟，确定没有悬浮的红细胞，冰浴 60 分钟或过夜。

2） 轻轻旋转离心管，使细胞悬浮。注意不要用吸管吹打，吹打会打散一些玫瑰花结。将细胞悬液小心加在 7 ～ 8ml Percoll 溶液上，室温中水平离心 500 × g 20 分钟。

3） 吸弃上层无细胞液体，将交界面的细胞和约 85 ％的 Percoll 溶液吸出，置另一离心管中。此即 E ^－ 细胞，应立即用 RPMI-1640 培养液洗去 Percoll 。

4） 收集 E ^＋ 细胞：尽量吸弃红细胞上的 Percoll 溶液，用 5ml Gey’s 液悬浮细胞 1 ～ 2 分钟，溶解红细胞。立即将加入同量两倍浓缩的 PBS ，恢复等渗，离心 500 × g 10 分钟，去上清液。再用 RPMI-1640 培养液同样洗涤 2 此。

5） 分别用 RPMI-1640 培养液悬浮 E ^＋ 和 E ^－ 细胞，计数细胞。用荧光标记的抗体测定制剂中的 B 细胞、 T 细胞和单核细胞百分比。

 

 

2 ）用尼龙毛分析 T 细胞

 

尼龙毛柱的制备（注意无菌操作）

1． 取直径 3D ，长度约 10cm 的尼龙毛，用 0.2mol/L HCl 浸泡处理过夜。用双蒸水洗净 HCl ，置 37 ℃烘干备用。

2． 称取 50mg 尼龙毛，均匀分散后置 Hanks 液中浸泡。取 1ml 注射器，出口接塑料管并夹住。将尼龙毛均匀填塞入注射器中，排净空气，柱高约 5 ～ 6cm 。此柱可分离约 2 × 10⁷ 细胞。将柱置－ 20 ℃可保存 2 ～ 3 个月。

 

 

分离细胞

1． 取 PBMC ，用含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培养液将细胞配成 2 × 10⁷ /0.5ml 。

2． 融化冻存的尼龙毛柱，以每分钟 5 ～ 7 滴的速度放出 Hanks 液。用 5ml 预温至 37 ℃的细胞培养液洗涤尼龙毛柱。将 0.5ml 上述 PBMC 悬液加入尼龙毛柱中，待细胞悬液全部进入尼龙毛柱后，立即加 0.2ml 细胞培养液，夹住塑料管。

3． 在 37 ℃ 5 ％ CO₂ 饱和水汽二氧化碳培养箱中培养 1 小时，使细胞与尼龙毛充分粘附。用 5ml 预温至 37 ℃的细胞培养液洗脱尼龙毛柱。洗脱液中含有纯的 T 细胞。 1000 × g 离心洗脱液 10 分钟，去上清液。再用细胞培养液洗涤细胞 1 次。计数细胞，用细胞培养液将细胞配成适当浓度。

 

 

3 ）用免疫磁珠法分离 T 细胞

 

将特异性抗 T 细胞单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠（ immunomangnetic beads ），用这种免疫磁珠从 PBMC 中结合 T 细胞。在磁场中，结合 T 细胞的免疫磁珠固定了，未结合的 B 细胞和其它细胞被洗脱下来。再从免疫磁珠上洗脱 T 细胞。