培养细胞系中基因表达的评估

培养细胞系中基因表达的评估

材料

试剂

冰乙酸

Amplify (Amersham)

抗体

一 抗（针对目的抗原）

二 抗（针对一抗）

目 的 细 胞 系 .• B H K - 2 1、 C H O K l 、 H E K 293

C h a s e 培养基：添 加 2 m m o l/ L 谷氨酰胺、 20 m m ol/L H E P E S 和 15ug/m l 未标记蛋氨酸的 M E M 培养基

E C L 化学发光试剂盒（A m e r s h a m )

裂解缓冲液

50m m ol/L T ris-H C l (p H 7. 6)

15 0 m m o l/L N aC l

2m m o l/L E D T A

1% (V fV s) N onidet P-40 (Sigm a-A ld rich )

甲醇

[ ₃₅S ] 蛋 氨 酸

牛奶

磷 酸 盐 缓 冲 液（P B S )

聚 丙 烯 酰 胺

SD S

饥 饿 培 养 基 ：添 加 2m m o l / L 谷 氣 醜 胺 和 20m m o l / L H E P E S 的 无 蛋 氨 酸 的 M E M

培 养 基

T r i s 盐 缓 冲 液（T B S )

Tw een-20

病 毒 储 存 液

根据方案 1 制备的表达目的基因的重组α病毒。

仪 器

细胞培养板（6 孔、 12 孔 和 24 孔）

H y b o n d E C L 尼龙膜滤器（A m e r s h a m )

Hyperfilm-MP

放射性强度探测器

S D S —— P A G E 设备

蛋白质印迹设备

方法
1.用梯度稀释的病毒储存液在 6 孔、 1 2 孔 或 2 4 孔板上感 染 相 应 的 细 胞（B H K -21、C H O K l 、 H E K 293)。

2.分析基因表达。

蛋白质印迹

a. 在感染后不同的时间点，每 个 6 孔 板 孔 中 加 入 250^x1 裂解缓冲液，冰上放置 l Omin。

b. 重悬细胞。

c. 上样样品，然后在正常标准下 1 0 % 〜12% S D S 聚丙烯酰胺凝胶电泳。

d. 将蛋白质转到尼龙膜上。

e. 4°C 下，将尼龙膜放在含 5% 牛奶和〇.1 % T w e e n -20 的 T B S 中孵育 30m i n 。

f. 室温下将尼龙膜放在一抗中孵育 30m i n 。

g. 室温下将尼龙膜放在二抗中孵育 30m i n 。

h. 根据厂商说明，用 E C L 化学发光试剂盒显示特异的蛋白质带。

代谢标记

a. 弃去细胞的培养基并用 P B S 洗潘一次。 _

b. 加人饥饿培养基， 37°C 孵 育 30m i n

C . 用 含 5 0 〜lOOuCi/m l 的 [₃₅S] 蛋氨酸的饥饿培养基替代饥饿培养基。

d. 37°C 孵育 20m in。

e. 弃去培养基并用 P B S 洗涤一次。

f•加人 chase 培养基，孵 育 15 min〜3 h 。

g. 弃 去 chase 培养基，用 P B S 洗涤一次。

h•每个 6 孔板的孔中加人 250ul 裂解缓冲液，冰上放置 lOmin。

i- 重悬细胞。

j•上样样品，然后在正常标准下 1 0 % 〜1 2% S D S 聚丙烯酰胺凝胶电泳。

k •室温下用 1 0 % 冰乙酸/ 3 0 % 甲醇固定凝胶 30m i n 。

1•用 A m p lify 替换固定溶液。室温下孵育 30m i n 。

m . 将凝胶晾干，进行放射活性鉴定并将凝胶放在 H y p e r f i l m - M P 中 2〜24 h 。

n•做 X 光片并观察放射性带。

原代细胞的感染
原代细胞，尤其是原代神经元，对物理和化学物质很敏感。应防止对这些细胞的多余操作，来自培养 B H K 细胞的培养基对神经元细胞有毒，建议使用对病毒储存液的纯化和浓缩步骤。

a•从 E 17 期胚胎中分离原代大鼠海马区神经元。

b•用添加了 1 0 % 马血清的 D M E M 培养基培养细胞。

c•往原代细胞中直接加入合适的病毒浓缩液。

d. 防止对细胞的多余操作。

e. 做时间点测试，以确定最佳的表达条件。