病毒滴度的确定

病毒滴度的确定

材料

试剂

抗体

一 抗（抗靶抗原的特异抗体）

荧光素偶联的二抗（一抗特异性的)

B H K - 2 1 细胞

根据研究，可以使用其他类型的细胞。

封闭缓冲液：含有〇.5 % 明胶海绵和 0•2 5 % 牛血清白蛋白的 P B S

完全培养基

针对使用的细胞类型选择。

D A B C O

甲醇

M g C l 2 (l m o l /L )

室温保存。

Moviol 4-88

磷 酸 盐 缓 冲 液（P B S )

铁 氰 化 钾（50m m o l /L )

4°C 保 存 。

亚 铁 氰 化 钾（50m m o l /L )

4°C 保 存 。

溶 于 DMF 或 DMSO 的 X-gal ( 2 % )

—2 〇°C 保 存 。

病毒储存液

按 照 方 案 1 制备的可表达 G F P 、β半乳糖苷酶或其他目的抗原的重组 a 病毒。

仪器

细胞培养板（6 孔 或 12 孔)

盖玻片

荧光显微镜

玻片

方法

基因表达的显示

1.将目的细胞系接种至 6 孔 或 12 孔细胞板上或盖玻片上。将细胞培养至一定的浓度。

2•用梯度稀释的可表达报道基因或目的抗原的病毒储存液感染细胞。

3.37°C 培养细胞过夜。

4 . 转染后 4 8 h 内确定滴度。

在早期的时间点，信号可能未达到最佳，一些突变的载体尤其是这样。在后期的时间点，细胞病变效应逐渐使细胞脱落。

通过检测 G F P 确定滴度

a. 用荧光显微镜检查细胞培养孔或盖玻片。

X-gal 染色确定滴度

a. 制备新鲜的 X -gal 染色溶液，将各种储存液稀释到 P B S 中至终浓度含 5m m o l / L铁氰化钾、 5m m o l / L 亚铁氰化钾、 2m m o l / L M g C l 2 和 l m g / m l X -gal。

b . 用 P B S 洗涤细胞。

c•用冷甲醇一 20°C 固定细胞 5m i n 。

d. 用 P B S 洗涤细胞三次。

e’. 室温或 37°C 用 X -gal 染色溶液染色细胞至少 2 h 。

f. 计 数 X -g a l 阳性细胞。

通过免疫荧光确定滴度

a•用 P B S 洗涤盖玻片两次。

b•用冷甲醇一 20°C 固定细胞 6 min。

c. 用 PBS 洗涤盖玻片 3 次。

d•室温下用封闭缓冲液孵育 30 min 以封闭非特异性的结 合 。

e•用一抗代替封闭缓冲液，室温下孵育 30 min。

f . 用 PBS 洗涤盖玻片 3 次。二抗室温孵育 30 min。

g•用 PBS 洗涤盖玻片 3 次，用水洗漆一次，空气中晾干盖玻片。

h. 将盖玻片在玻片上用 IOmI 含 2. 5 % DABCO 的 Moviol 4-88 封片

i . 用荧光显微镜观察。计数阳性细胞。

5•将阳性细胞数与稀释倍数相乘，将滴度表示为感染颗粒数/m l。