重 组 Ct 病毒载体的制备

重 组 Ct 病毒载体的制备

材料

试剂
琼脂糖

Aprotinin (10 mg/ml)

仓鼠幼鼠的肾细胞（B H K -21)

使 用 B H K -21 黏附细胞培养物制备重组 S F V 和 S I N 颗 粒 ，用 B H K -21 悬浮细胞大量制备蛋白质产物。中 国 仓 鼠卵巢细胞（C H O K l ) 和 人 胚 胎 肾 细 胞（H E K 2 9 3 ) 可用于表达研究。

帽 类 似 物（m 7 G [5’] PPP [ 5’ G )

cr 胰凝乳蛋白酶， 20m g / m l

完全 B H K 培养基

将 Dulbecco’s modified F-12 培养基和 Iscove’s modified 培养基 I : 1 混合后，加上 4 m m o l / L

谷 氨 酸 盐 和 1 0 % 胎 牛 血 清（F C S )。

D TT, 50 mmol/L

D M R IE -C (Invitrogen)

乙 醇（7 0 % 和 9 5 % ， V / V )

O pti-M E M I 低 血 清 培 养 基

苯 酸 ：氯 仿 ：异 戊 醇（25 : 24 : 1 ， V / V / V )

质粒

p SIN R ep 5 (Invitrogen)

pSIN rep504

S I N 辅 助 载 体 D H -B B

S IN 辅 助 载 体 D H -B B ( 2 6S) 5’ S IN (Invitrogen)

所 有 S I N 和 S IN S 助 载 体 都 需 经 过 酶 切 线 性 化 。

p S F V l ( S 扣 I 线 性 化）

p S F V 2 g e n (JVrwI 线 性 化）

p SFV -h elp er2 载体

p SF V -h elp erS2

p S F V -h e lp e rC S 2 19 A

将所有 S F V 载 体 用 I 线性化。

P B S

限 制 性 内 切 核 酸 酶 ： JVoZ I 、 JV ra I 、 _Pac I 、 S a p I 、 S f e I 、 _X7io I

R N A 酶 抑 制 物（1 0 〜 5 0 U /ul )

r N T P 混 合 物

10 m m o l/L rA T P

10 m m o l/L rC T P

10 m m o l/L rU T P

5m m o l/L rG T P

IO X S P 6 缓 冲 液

400m m ol/L H E P E S (p H 7. 4)

6 0 m m o l/L 乙酸镁

2 0 m m o l/L 亚 精 胺

1 5 X S P 6 缓 冲 液

SP6 R N A 聚 合 酶（1 0 〜 20U/uD

胰 酶 -E D T A

〇 . 2 5 % 胰 酶

lm m o l/L E D T A

无 R N A 酶水

仪器

细 胞 培 养 板（6 孔 、 1 2 孔 和 2 4 孔）

电 穿 孔 管（〇 • 2 c m 和 0. 4 cm )

电 穿 孔 仪（B ioR ad G ene P u lser)

18•加人 aprotinin 至终浓度为 250 ug/ml以终止反应。
激活的 S F V 颗粒可用于感染