RT-PCR 在基因表达检测中的应用

基因表达的检测有几种方法。经典的方法（仍然重要）是根据在细胞或生物体中所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一特定基因是否表达。随着大分子分离技 术的进步使得特异的基因产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。

随着重组 DNA 技术的运用，现在有可能检测。分析任何基因的转录产物。目前有好几种方法广泛应用于 于研究特定RNA分子。这些方法包括原位杂交、NORTHERN凝胶分析、打点或印迹打点、S－1 核酸酶分析和RNA酶保护研究。这里描述 RT-PCR 从 RNA 水平上检查基因表达的应用。

RT-PCR检测基因表达的问题讨论

关于 RT-PCR 技术方法的描述参见 PCR 技术应用进展， 在此主要讨论它在应用中的问题。理论上 1μL 细胞质总 RNA 对稀有 mRNA 扩增是足够了（每个细胞有1 个或几个拷贝）。

1μL 差不多相当于 50－100，000个典型哺乳动物细胞的细胞质中所含RNA的数 量，靶分子的数量通常大于50，000，因此扩增是很容易的。该方法所能检测的最低 靶分子的数量可能与通常的 DNA PCR 相同；例如它能检测出单个 RNA 分子。

当已知量的转录 RNA（用 T7RNA 聚合酶体外合成）经一系列稀释，实验结果表明通过 PCR 的方法可 检测出 10 个分子或低于 10 个分子，这是反映其灵敏度的一个实例。用此技术现已从不到 1 个 philadelphia 染色体阳性细胞株 K562 中检测到了白血病特异的 MRNA 的转录子。

因此没必要分离 polyA+RNA，RNA/PCR 法有足够的灵敏度来满足绝大多数实验条件的需要。

将 PCR 缓冲液同时用于反转录酶反应和 PCR 反应，可简化实验步骤。我们发现整个 反应过程皆用 PCR 缓冲液的结果相当于或优于先用反转录缓冲液合成 CDNA，然后 PCR 缓冲液进行 PCR 扩增循环。当然，值得注意的是 PCR 缓冲液并不最适合第一条 DNA 链的合成。我们对不同的缓冲液用于大片段 DNA 合成是否成功还没有进行过严格的研究。

反转录酶的选择似乎对实验方法成功与否并不十分重要。BRL 和BOEHRINGERMANN HEIM 的 MULV 反转录酶进行全面的研究，但没有理由认为来源可靠的反转录酶不能适用 于该方法。在研究中，我们仅使用了PERKINELMER/CETUS 公司生产的 TAQ 聚合酶。

cDNA 第一条链的合成可用不规则六聚体、寡聚(dT)或 PCR 下游引物来启动反应。 如果用寡聚(dT)，一般每次反应加 0.1μL 就够了。如果用下游寡核苷酸作为第一条链 的起始引物，10-50pmol 最为理想。反转录反应以后，加入适量的上游和下游引物进行 PCR 反应与用不规则六聚体方法一样。

三种启动方法中无论用那一种最后得到的扩 增产物都同样理想。而加入不规则六聚体似乎更容易得到前后一致的结果，且靶序列 的合成量通常最多(E.S.K.)加入不规则六聚体方法一样。三种启动方法中无论用那一 种最后得到的扩增产物都同样理想。

而加入不规则六聚体似站更容易得到事一致的结果，且靶序列的合成量通常最多(E.S.K.未发表)。第一条链合成完毕，不必加碱或 RNA 酶以除去 RNA 模板。95℃ 热处理使反转录酶失活，同时也使 RNA-DNA 杂合子变性。

不必加碱或RNA酶以除去 RNA 模板。95℃ 热处理使反转录酶失活，同时也使 RNA-DNA 杂合子变性。残留的 RNA 模板似乎对 PCR 反应无干扰。

寻找使 PCR 反应产生良好扩增结果的最低浓度的寡核苷酸引物是十分重要的。我 们发现过量的引物通常会产生许多妨碍随后分析的额外扩增产物。浓度为 5pmol 的引物可得到非常清晰及有效的扩增产物。当然，最好是找到你要扩增的每个序列的最佳引物量。

没有必要用全部的 cDNA 反应产物进行PCR扩增。可取等分量 cDNA 样品用几组 不同的引物作 PCR 分析;例如:一份 cDNA 反应物可用于研究几种不同类型的 RNA。cDNA反 应物通常用 PCR 缓冲液衡释 5 倍。将cDNA的浓度隆低至 0.2mM，此浓度更适于 Taq聚合酶。

dNTP 浓度不应超过 0.2mM，因为较高浓度的 dDTP 使 Taq 聚合酶的错误掺入或突变率增高。对于扩增来说，即使 dNTP 的浓度低到 0.05mM 也不会出现问题。

镁离子浓度对反应十分重要，因此应注意将镁的摩尔浓度保持恒定。有时核酸溶 于含 1mMEDTA 的缓冲液中，EDTA 可歼螯合大多数镁离子。通常，PCR 反应中游离镁离子浓度应保持在 2 mM。

将 PCRA 循环次数减少，不可避免地产生许多非特异性的扩增产物。很容易将长度 不同的 DNA 的扩增。即使基因组序列得到扩增，当引物与大小不同的外显子结合时， 很容易将长度不同的 MRNA 与基因组的产物区别一来。

如果不了解基因组的结构，选用与 5' 编码基因间隔 300-400bp 的引物，脊椎动物的外显子很少大于 300-400bp，因此很容易从不同的外显子中导出引物。

所研究的基因无内含子、或者研究完整原病毒 RNA 转录，为了获得有关 PCR 的结果有必要用 DNA 酶彻底处理 RNA。只要有很少量的基因组 DNA 污染，用此方法分析就会出现假阳性结果。

实际应用举例
基因表达检测

用该方法先后扩增，检测了许多不同类型的细胞、组织和器官的 mRNA。当然，仅检测 mRNA 并没有新颖之处，它的新颖在于能对 10-1000 个细胞的 RNA 进行分析。所需起始物质比通常的低很多，这使得研究者能设计并进行以前看是不可能进行的实验。

例如研究血细胞生成的研究人员经常用群体分析确定生长因子或环境对特殊细胞系发 育的影响。经常部到的一个问题是:群体细胞产生的何种生长/分化因子会影响其本身 的发育。现在可以确信，利用 RNA/PCR 技术能够对数百个群体的 mRNA 对任何与生长或分化有关的因子进行分析。

而用常规的杂交或抗体检测方法来分析它们是极其因难、 甚至是不可能的。RNA/PCR 技术在研究转基因动物方面将非常有用。我们常常不仅要知道在动物体内转移的基因是否表达，而且要知道是在哪些细胞，组织或器官中表达。

随着 RNA/PCR 检测灵敏度的提高，能够检测转基因动物的多个部位而不必为取样 而将它处死。我们还可以列举许多这样的例子，但我们留给读者一些有关检测方面的 设想。

用于诊断的 RNA 序列的扩增

在许多情况下，一个特异性的 RNA 分子可作为感染或遗传/癌疾病的诊断。在反转 录病毒疾病领域中，检测与具有侵染活性密切相关的反转录病毒RNA基因组或特异转录子是否存在是非常重要的。现已对 HIV-1 病人，HTLV-1，2 以及 Moloney MulV 的细胞株进行了研究。

也可以用 RNA/PCR 比较容易地检测出常见的感冒病毒即人鼻病毒。对 RNA 和DNA 病毒的 RNA 转录子的分析有利于对病毒的潜伏期，复制期等生活周期进行研 究。

在某些类型的癌细胞中有新的 mRNA 表达。如慢性骨髓性白血病(CML)。某些急性 淋巴白血病(ALL)和急性骨髓白血病(AML)，只在病人的白细胞中发现有嵌合的mRNA (BCR-ABL)。此嵌合 mRNA 是诊断此类疾病存在的良好依据。在许多肿瘤的治疗过程中，肿瘤细胞对化学治疗具有抗性。

DNA 水平的扩增并不一定导致表达的增加，但大量相应的 mRNA 的存在则使表达增加。DNA 水平的扩增并不一定导致表达的增加，但大量相应的 cDNA 的存在则使表达增加。

用 RNA/PCR 方法来分析复合抗药性(MDR)10基因和胸腺核苷酸合成酶(TS)基因，发现了这 mRAN 水平的增高。突变的 RAS 原癌基因的 mRNA 分析(见参考文献 25综术述)在癌症的诊断或预测方面具有诊断价值。

mRNA 分析比常规的 DNA 基因组分析有优越之处。由于没有内含子序列干扰 mRNA的扩增，因此可以仅用 组引物就能够扩增 H-，K-，和 N-RAS 三个 mRNA 序列(E.S.K，未发表)。这样便可以比较 容易地检测出第 12、13 和 61 密码的突变，这些突变被认为是发生癌的原因。

癌症诱因的检测

在下面将列举数个 RNA/PCR 扩增方法的主要应用。首先是对鼠鸟氨酸氨甲栈基转移酶 mRNA 进行亚克隆来确定缺失点突变的位置。

同样，该方法可用于检测哺乳动物细胞 mRNA 转录后的剪接，研究与HLA疾病相关性因素，分析人 HPRT 突变，研究自身免疫 与T细胞受体序列之间的关系，分析人碱性磷酸脂酶的突变，研究土拨鼠肝炎病毒引发的 c -myc 活性，确定刺桐丁蛋白4.1mRNA 的剪接变异，等等。

根据已发表的序列合成扩增 mRNA 的引物，我们发现用 RNA/PCR 是获取 cDNA 的最简便的方法。用在 5' 末端带有限制性内切酶位点的引物来扩增 mRNA 的一部分或全部编码区域。扩增后，PCR 产物经合适的酶切并与适于表达的载体连接或制备成探针。

按此方法可在一星期内完成从 RNA 样品到用于高效表达的修饰 cDNA 克隆。这比常规的合成/筛选 cDNA 库，亚克隆靶 cDNA，为达到表达目的而对克隆进行诱变等过程要简单得多。

区别主要在于用于扩增和分离 cDNA 克隆的引物为简并引物。引物序列是根据氨基酸的序列而定的，因此当只知道很少的蛋白质序列时，就有可能扩增特异的 RNA 分子。

当只知一个内部序列时，只用一个基因特异性寡核苷酸引物，也可用 PCR 从稀有mRNA 中分离出 cDNA。扩增 cDNA 的分析因使用本书其它章切有关 PCR 产物的直接序列分析步骤而变得简单。将噬菌体(T7)启动了作为 PCR 引物的一部分同样可用于序列分析，因为 PCR 终产物中有大量的群体特异的产物。