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    基本方案3 B-PULSE 淋巴细胞迟复制显带

    相关实验：染色体显带技术

    最新修订时间：

    材料与仪器

    加有植物血凝素（PHA) 的淋巴细胞培养基 BrdU 2'-脱氧胞苷酸 秋水仙素溶液
    合适容积的组织培养瓶

    步骤

    1. 在合适容积的组织培养瓶中制备P H A 处理的淋巴细胞培养基，孵 育 2d。 2 . 在第3 天的上午9 点钟，在每一个培养瓶中加人l 〇 mmol/L B r d U 和 10mmol/L dC， 终浓度分别为lOO^mol/L 。 孵育6h 。 3. 加 人 10|ug/ml秋水仙素，终浓度为〇 .〇 5哗 /1111， 37°C孵 育 30min。 4•收获分裂中期细胞，制备染色体玻片。 5 . 使 B r d U 复制的染色体显带（ 支持方案3〜5)。 备选方案2 T-P U L S E 淋巴细胞迟复制显带 此法用于制备G 显带或Q 显带染色体。将失活的X 染色体突出显色，从而区分女 性的两条X 染色体。在细胞周期的早S 期 ，在培养基中加入B r d U 。 附 加 材 料 （ 见基本方案3) 加有或不加lOjumol/L 的胸腺嘧啶的组织培养基（ 由 lm m 〇 l/L 的胸腺嘧啶原液稀 释，附 录 1)， 37°C。 1. 制备P H A 处理的淋巴细胞培养基，并孵育。 2. 培 养 至 次 日 ， 8: O O 〜 10: Q O p m ，在 每 一 个 培 养 瓶 中 加 人 l〇 m m 〇 l/L B r d U 和 l〇 m m o l / L d C ，终浓度分别为l O O p m o l/L 。孵 育 10〜1 2 h 。 3. 培养 至 第 3 日，于 8: 00a m ，将细胞和培养基转移至离心管内， I80g■室温离心 8m i n ，弃上清
    4 . 加 入 2m l 新配制的不含有B r d U 和 d C 的组织培养基，温度为37°C 。摇动离心管使细 胞沉淀重新悬浮。 5. 180g 室温离心8min，弃上清。 6 . 加 入 5m l 新配制的含有lC^ m o l /L 的胸腺嘧啶的组织培养基，温度为3 7° C 。孵 育 5 h ， 使胸腺嘧啶掺入迟复制的D N A 。 7 . 加 入 10jug/m l 的秋水仙素，终浓度为〇.〇5jng/m l ，解 育 30min。 8 . 收获分裂中期细胞，制备染色体玻片。 9 . 使 B r d U 复制的染色体显带（ 支持方案3〜5)。 备选方案3 B-PULSE成纤维细胞迟复制显带 1 . 在装有活跃生长的成纤维细胞（ 传代约24h 后）的培养瓶中，加 入 l〇 m m 〇 l / L B r d U 和 10m m o l /L d C ，终浓度分别为lOO^m o l /L 。孵 育 10〜12h 。如果没有得到预期的 带型，可在一定的时间范围内确定最佳的周期时间（ 如可每次增加l h 、 6〜13h)。 2 . 加 入 10p g / m丨的秋水仙素，终浓度为〇.〇5|ug/m l ，孵 育 30min。 3 . 根据所培养的不同细胞，用不同的方法收获分裂中期细胞，制备染色体玻片。 4•使B r d U 复制的染色体显带（ 支持方案3〜5)。 备选方案4 T-PULSE成纤维细胞迟复制显带 附加材料 （ 基本方案3) 加有或不加有l〇 M m o l/L 胸腺嘧啶的组织培养基（ 由 lOnimol/L 的胸腺嘧啶原液稀 释，附 录 1)， 37°C 1 . 在开始培养当日的约5 :00p m ，于装有生长活跃的成纤维细胞（ 传代约24h 后）的 细颈瓶中加入10mmol/L B r d U 和 10mmol/L d C 溶液，终浓度分别为100jumol/L 。 孵育约16h 。如果采用推荐的孵育时间没有得到预期的带型，则应根据经验确定最 佳的孵育时间（ 备选方案3 , 第 1 步） 。 2•去除含有B r d U 和 d C 的培养基，以新配制的37°C 、不 含 B r d U 和 d C 的组织培养基 洗涤细胞。加人新配制的37°C 、含 有 l O p m o l/L 胸腺嘧啶的培养基，孵育约6h 。 3 . 加 人 lO^g /m l 的秋水仙素，终浓度为0. 05jug/m l ，孵 育 30m i n 。 4•收获分裂中期细胞，制备染色体玻片。 5 . 使 B r d U 复制的染色体显带（ 支持方案3〜5)。 支持方案3 用荧光染料使B r d U 参与复制的染色体显影 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) 9 0 % 、 7 0 % 和 30% O V V ) 的乙醇 V P B S V Hoechst 33258 染液 A 制备B r d U 参与复制的分裂中期染色体玻片（ 基本方案3 或备选方案2〜4) VMcIlvaine 缓冲液， p H 7. 5
    配备有适合滤光片的突光显微镜， IOOXZeiss Neofluar或 Olympus的 S-planapo物 镜，装有胶片的相机（ 如 Kodak Technical Pan) 1 . 准备一系列含有以下溶液的染色缸，然后按如下方法处理B r d U 参与复制的分裂中 期染色体玻片： 分别在9 0 % 、 7 0 % 和 3 0 % 乙醇中各2min; 水中2min; PBS 中 5min; Hoechst33258 染液 A 中 IOmin; PBS 中2min; 迅速用水冲洗2 次 （ 于不同的染色缸内） 。 染色后玻片避光保存，如果不是立即用玻片，应将玻片晾干。 2 . 用 p H 7. 5 的 McIlvaine缓冲液封片，加盖玻片。在配备有适合滤光片的荧光显微镜 下 观 察 （ Hoechst吸收356n m 光，在 465n m 发出焚光） 。 3 . 在 100 X 的物镜下，曝光时间范围为15〜30s，以 Kodak Technical P a n 胶片在 A S A 200下立即拍照。如有需要，调整A S A 或用更快的胶片（ 如 KodakTri-X )。如 果相机有自动曝光系统，将其设置为束点曝光，将一条染色体放在光点上。 4•避光保存玻片，以便将来再检查用，取下盖玻片，空气晾干玻片即可。再检查前可 用 McIlvaine缓冲液封片，加盖盖玻片。 支持方案4 用光照法和吉姆萨染色使B r d U 参与复制的染色 体显影 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) 制备BrdU参与复制的分裂中期染色体玻片（ 基本方案3 或备选方案2〜4) V P B S • VHoechst 33258 染液 A 和 B •72X S S C 溶液， 60°C 或 65°C 4 % (V A 0 吉姆萨染液（ 生物/医学专用或Fisher; 用之前以水溶解） IOOmmX IOOmmX 15m m 带盖的方形塑料盘 24m m X 60m m 的盖玻片 20W 的荧光灯 带有绿色干扰滤光片的亮视野显微镜，装有细粒度胶片的相机（ 如 Kodak Technical Pan) 1 . 将 BrdU参与复制的分裂中期染色体晚片在P B S 中预浸渍5min，然后在Hoechst 33258染液A 中浸染10min。 2 . 滴干玻片，放人IOOmmX IOOmmX 15m m 方盘内，盘底放有两张玻片或玻璃棒作为 支持物。在玻片上滴加Hoechst 33258染 液 B3 或 4 滴，盖 上 24mmX 60m m 的盖 玻片。 3•将方盘加盖，放在20W 的荧光灯下，距离为5〜7. 5c m ，时间最少为6h。在盘底加
    —薄层PBS，防止变干。 4•在流动的热自来水下将盖玻片冲掉（ 勿撬起盖玻片） 。 5•将玻片放入预热的2X S S C 溶液中15min。流动水彻底冲洗。 6•用4 % 的吉姆萨染液染色lOmin。 7•水冲洗，空气晾干。 8♦ 亮视野显微镜下观察，加绿色干扰滤光片可拍摄黑白照片。在设置为50〜IOO的 A S A 下，用细粒度胶片拍照，注意曝光时间要短。 支持方案5 用热处理和吉姆萨染色使B rd U 参与复制的染色体显影 此技术比光照和吉姆萨染色法简单，但效果不甚稳定。 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) 掺有BrdU 的分裂中期染色体玻片的制备（ 基本方案3 或备选方案2〜4) V I .Omol/L 的磷酸钠缓冲液， pH 8. O 4 % (W V ) 吉姆萨染液（ 生物/医学专用或Fisher; 用之前以水溶解） 87〜90°C 的热水浴 带有绿色干扰滤光片的亮视野显微镜，装有细粒度胶片的相机（ 如 Kodak Technical Pan) 1-将玻片放入？1^8.0、 1.〇111〇1/[的磷酸钠缓冲液中， 87〜92°(：水浴1〇1^11。在水中晃 动玻片以漂洗。 2•在4 % 的吉姆萨染液中染色5〜7min。 3. 水冲洗并空气晾干。 4 . 亮视野显微镜下观察，加绿色干扰滤光片可拍摄黑白照片。在设置为50〜100的 A S A 下，用细粒度胶片拍照，注意曝光时间要短。

    来源：丁香实验

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