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    干细胞与心肌组织工程

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

     

    心 脏 心 肌 细 胞 的 分 离

    临床应用中，人类心肌细胞可能是最合适的细胞来源。来自活检、供体器官或者不要的组织获得的自体或异体细胞在构建生物合成移植物方面都有应用价值。 目前，在组织工程研究最常使用的是动物模型，其中新生大鼠心室肌细胞是最常使用的细胞。下面的细胞分离方法是专为分离 2 日龄大鼠心室肌心肌细胞而设计的，当然，这一方法也适用于其他分离系统。
    1 ) 材料和试剂 ⑴ 动 物 ： 2 日龄大鼠； (2) 水浴加热摇床； (3) 无菌培养瓶； ⑷ 细 菌 级 培 养 皿 ， IOOml; (5) 无菌手术器械(镊子和剪刀)； (6) 无 菌 的 无 Ca2+、 M g 2+的 H a n k 平 衡 盐 溶 液 ，加 入 H E P E S (10mmol/L )使其 p H 7.4(H B S S H )； (7) 生长培养基(参见培养基的选择)； (8) 两 个 250m l 的烧杯，一 瓶 7 5 % 乙醇； (9) 用 P B S 配制 的 0.1% 的胰酶溶液，使用前新鲜配制； (10) 无菌棉球或小纱布块； (11) 无 菌 50m l 的离心管； (12) 细胞支持材料(如培养皿、微载体、胶原或聚乳酸缝线、盖玻片等)，前一天用 纤维蛋白原包被(参见支持材料的准备)； (13) 无菌吸管， lml、 10m l 、 25ml; (14) 血细胞计数器或别的细胞计数器； (15) 50m l 的离心管； (16) Falcon细胞滤网。 2 ) 步驟 注意：动物应根据当地动物保护和使用委员会(I A C U C )制定的手册进行处置。 (1) 在 IOOml的培养皿加入25m l 无 菌 的 H B S S H ，用于放置解剖的心脏。 (2) 把解剖器械放入盛有7 5 % 乙醇的烧杯中。 (3) 用 7 5 % 的酒精棉球或纱布擦拭层流间工作区。 (4) 根据当地I A C U C 手 册 ，麻醉动物并使其安乐死。安乐死后要快速进行解剖。 (5) 用 7 5 % 的酒精棉球或纱布擦拭动物腹部(从颈部到小腹)。 (6) 用利剪在大鼠的腋窝处沿胸部剪一个横向切口。 (7) 用镊子快速而细致的取出心脏，放入含有H B S S H 的培养皿中。 (8) 处理尸体。 (9) 在无菌水中清洗解剖器械，放 回 7 5 % 乙醇中。 (10) 重复步骤⑶ 〜(9道到取 完 心 脏 。整个过程要无菌操作。 (11) 检查每一颗心脏，清除任何肺组织或别的非心肌组织。 (12)将 组 织 移 入 I O O m m 的干净而干燥培养皿中，剪 碎 成 1〜 2m m 3大小。这一步很 关键••组织剪得太碎会导致在下面的清洗过程中丢失细胞，太粗消化后细胞还留在残余 的组织中。 (13) 加入无菌的H B S S H ，用吸管将剪碎的组织块和液体一同吸入培养瓶中。 (14) 轻轻吹打组织块洗去血细胞和碎片，轻轻倒掉漂洗液，组织块留在旋转瓶中。 (15) 在剪碎的组织中加入10倍体积的0.1%的胰酶消化液，放 人 3 7 1 、 140r/m i n 的 水浴中孵育8min。把酶液倒入不用的烧杯中
    (16) 重复步骤(15)—次。前两步主要是血细胞，弃之。 (17) 将 10倍体积的0.1%的胰酶消化液加入剪碎的组织中，放 入 3 7 1 、 140r/min的 水浴中孵育8min。 将酶液吸入含有Im l生长培养基的IOml的离心管中。 (18) 重复步骤(17)，直到组织块消化完全。 (19) 用滤网过滤去除未分散的组织块。 (20) 1200r/min离 心 4min, 收集细胞。离心结束时，彳喷倒出上清，当心不要晃动细 胞团沉淀物。加入生长培养基重悬细胞。 (21) 用血细胞计数器或细胞计数器统计台盼蓝着色细胞。 (22) 用生长培养基将细胞稀释到IxlO6个/ml

    胚 胎 干 细 胞 来 源 的 心 肌 细 胞 的 获 得

    胚胎干细胞主要来自建系的细胞系，可以购买或别的实验室惠赠。采用合适的诱导剂和基因工程方法都可获得分化效率较高的心肌细胞。相比较而言，采用诱导剂进行诱导比较简单，易于操作，分化来的心肌细胞安全，比较适合作为心肌组织工程的种子细胞 。本方法主要适用于采用诱导剂诱导获得心肌细胞的方法。

    胚胎干细胞扩增至足够使用的量后，在悬浮培养皿中形成拟胚体，低密度接种在细胞培养皿中，并加入诱导剂进行诱导。分化来的心肌细胞用 Percoll 密度梯度离心的方法进行富集 (Xu et al.2002)

    1 ) 材料和试剂 (1)胚胎干细胞； ⑵ 10m m 、 15m m 的组织培养皿、 15m m 的细菌悬浮培养皿、 IOml的离心管； (3) 生长培养基、诱 导 液 D M S O 、抗坏血酸等； (4) 相差显微镜； (5) 58.5% 和 40.5% 的 Percoll 液 ； (6) 0.25% 胰酶+0.02% EDTA 的消化液； (7) 0.1%的胶原酶溶液、高 K+液 ； (8) 2 0 0 目的滤网； (9) 离心机。 - 2 ) 步驟 (1) 胚胎干细胞在常规条件下进行扩增。 (2) .将胚胎干细胞接种悬浮培养皿进行悬浮培养，以形成拟胚体。 0 ) 悬 浮 培 养 5〜 9 天后，将拟胚体接种细胞培养皿，接种密度为1~3个/mm2, 并加 入 DMSO或抗坏血酸等诱导剂进行诱导。 (4)经过8〜10天的诱导分化，相差显微镜下可见跳动的心肌合胞体。 ⑶胰酶消化 跳 动 的 心 肌 合 胞 体 2〜 4min，或在镜下观察细胞开始成片脱落时，用生 长培养基中止消化，并用吸管轻轻吹打细胞，使其脱落。细胞成片脱落。 (6) 将成片脱落细胞移入培养瓶中，吸去液体，尽量吸干净。加入胶原酶消化液， 置 于 37t 、 5 % C O 2孵箱中孵育20min。 (7) 轻轻吸去消化液，用无菌的P B S 清洗细胞一次，加 入 高 K+液 ，室 温 放 置 IOmin
    后 ，用吸管轻轻吹打分散细胞。 (8) 滤网过滤去除未消化的残渣， 1200r/min、 4m i n 离心收集细胞。 (9) 用生长培养基重悬细胞。 (10) 在 IOml的离心管中，依次加入58.5%的 Percoll液 3m l ，40.5%的 Percoll液 3m l , 细胞悬液3m l , 1500g 离 心 30min。 (11) 细 胞 在 58.5%和 40.5%两 种 Percoll浓度液界面处形成细胞分离带，收集该带及 之下的细胞，并用无菌的P B S 清 洗 3 次 。 (12) 收集细胞，并用生长培养基重悬，制成所需浓度的细胞悬液

    预制生物支架材料的准备

    (1) 用无菌的去离子水漂洗材料。 (2) 在 7 5 % 乙醇溶液中浸泡24h 。 (3) 用无菌的去离子水漂洗。 (4) 材料储存在无菌的Dulbeccos的憐酸盐缓冲液中。 ⑶准备市售的纤维蛋白原溶液:l m g 包装的纤维蛋白原中加入IOml无菌去离子水， 数小时后使用以保证纤维蛋白原溶解，层粘连蛋白也可以同样的方式准备。 (6)支 持 材 料 在 市 售 纤 维 蛋 白 原 溶 液 中 浸 泡 24h。 (7) 使用前用细胞培养液漂洗支持材料

    液 态 肢 原 支 架 的 准 备

    9 . 5 . 3 . 2 液 态 肢 原 支 架 的 准 备 从成年大或小鼠的鼠尾获取胶原，主要为I 型。 1 ) 材料和试剂 (1) 成年大白鼠； (2) 镊子、剪刀、止血钳、烧杯、平皿、离心管等； (3) 7 5 % 乙醇、 0 . 1 % 的无菌稀乙酸、无 菌 的 P B S ; (4) 离心机。 2 ) 步骤 (1) 成年大白鼠，引颈处死，从尾根部切断鼠尾，放 入 7 5 % 乙醇中浸泡30min。 (2) 用止血钳夹住鼠尾根部，撕去皮肤。 (3) 撕下白色尾腱，置于平皿中，用无菌的P B S 清洗掉尾腱上的血污。 (4) 将尾腱剪碎成2~3m m 长度。 (5) 取 1.5g 剪碎尾腱浸入150m I 0.1%的乙酸溶液，至 4 1 冰箱中，并不时摇动， 48h 后 ，移入灭菌离心管中。 (6) 以 4000r/m i n 离 心 30min，吸取上清液， -20X ：保存

    温 敏 材 料 的 制 备

    聚 M 异丙基丙烯酰胺(P I P A A m )在 3 7 ¾ 时心肌细胞在其上能够很好的贴附生长，但 当温度降至22X 1时 ，细胞便同材料相分离(Zimmermann et al.2000)。 1 ) 材料和试剂 ⑴ 异 丙 烯 酰 胺 (I P A A m )单体、丙烯酰胺(A A m )单体、丙 醇 ； (2)电子束激发器； ⑶ 盖 玻 片 、培养皿； ⑷ 氮 气 、环氧乙烷、蒸馏水。 2 ) 步骤 (1) 将 I P A A m 单体 溶 于 2-异丙醇中，形 成 I P A A m 溶液。 (2) 在聚异丙烯组织培养皿的表面铺上一层I P A A m 溶 液 ，并用电子束进行照射，使 得单体聚合并共价铰链到培养皿的表面。 ⑶ 用 冷 蒸 馏 水 清 洗 接 枝 P I P A A m 的培养皿，去 除 未 接 枝 的 I P A A m , 并在氮气中 干燥。 ⑷用方形的玻璃盖玻片(24m m x 24m m )覆盖接枝P I P A A m 的表面。 (5) 将 A A m 单体溶于丙醇中，形 成 A A m 溶液。 (6) 用丙烯酰胺溶液覆盖步骤(4)培养皿的表面，并用电子束进行照射、清洗。 (7) 在培养皿用盖玻片覆盖处形成方形的P I P A A m 接枝区域，细胞贴附区域；而其 周围为聚A A m 区域，细胞不贴附。 (8) 使用前用环氧乙烷气体消毒灭菌。

    采 用 预 制 生 物 材 料 支 架 构 建 工 程 化 心 肌 组 织 的 方 法

    1 ) 材料和试剂

    (1)支 架 材 料 、多孔海绵状或纤维状 (按照预先成型的支架材料的准备方法进行准备)；

    (2) 心肌细胞悬液；

    (3) 吸管、纱布、培养皿、 6 孔培养板；

    ⑷ 培 养 液 。

    2 ) 步骤

    (1) 心肌细胞调成一定浓度的细胞悬液。

    (2) 细胞接种前一天，支架材料用培养液浸泡 24 h。

    (3) 取出支架材料，置于无菌纱布上，以吸去纱布中大部分培养液。

    (4) 用吸管吸取细胞悬液滴加在材料上，培养液连同细胞一起被吸入支架材料中。

    (5) 将细胞/支架复合体置于 6 孔培养板孔中， 3 h 后加入培养液进行培养。

    (6) 根据培养液颜色变化更换培养基。

    (7) 经过 2——3 天培养可观察到心肌细胞在支架材料上节律性的搏动。

    基 于 液 态 肢 原 为 支 架 构 建 工 程 化 心 肌 组 织 的 方 法

    1 ) 材料和试剂

    (1) 液态胶原；

    ⑵心肌细胞悬液；

    ⑶ D M E M 生长培养基；

    (4) 0.1mol/L 的 N a O H ;

    (5) 精密试纸、吸管；

    (6) 胶原铸模装置。

    2 ) 步驟

    (1) 液态胶原与 2x D M E M 等比例混合，用吸管吹打均匀。

    (2) 用 〇.lmol/L 的 N a O H 将混合物 pH 调为 7.0——7.4。

    (3) 在上述混合液中添加促心肌细胞生长发育物质。

    ⑷细胞悬液与步骤⑶混合物充分混合，形成的细胞/胶原混合液加入铸模槽中铸成所需形状。

    (5) 40m i n 后加入生长培养基进行培养，隔天更换培养液。

    (6) 经 过 5〜 8 天的培养可观察到一致跳动的工程化心肌组织的形成。

    基 于 细 胞 片 层 叠 加 构 建 工 程 化 心 肌 组 织 的 方 法

    1 ) 材料和试剂

    种子细胞、温敏材料、生长培养基、培养皿、吸管。

    2 ) 步骤

    (1) 新生大鼠心肌细胞接种在温敏细胞培养表面，置 于 3 7℃ 、 5 % C 0 2 孵箱中培养4 天 。

    ⑵ 将 培 养 皿 置 于 20T 的 C O 2 孵 箱 中 孵 育 lh，心肌细胞成片层脱落，漂浮在培养基中。

    ⑶ 立 即 将 整 个 细 胞 片 层 ，连同培养基一起吸入 IOml 的吸管的尖部，移到另一个培养皿的表面。

    ⑷在细胞片层中部滴加培养基，以使折叠的部分摊开。

    ⑶ 轻 轻 吸 去 培 养 基 ，使得细胞片层贴到培养皿的表面。 30 min 后 ，重新加人培养基，这时细胞片层已贴壁。

    (6) 将另一个细胞片层以同样的方法转移到第一个细胞片层上方，定好位置以使两细胞片层充分重叠。缓慢吸去培养基以使两细胞片层相接触。 30 min 后再次加入培养基。

    (7) 重复步骤 (6)，将细胞片层叠加，构建工程化的心肌组织

    生 物 反 应 器 培 养

    步骤

    (1) 拆开生物反应器，用无菌的去离子水彻底清洗。

    (2) 对生物反应器进行灭菌。可用环氧乙烷气体，或 7 0 % 乙醇消毒。

    (3) 用前再次用无菌、去离子水清洗生物反应器。检查接口处以及硅胶气体交换膜是否漏液

    (4) 利用可能的入口点将支持材料、细胞悬液和培养基装入生物反应器。去除可能存在的气泡。接种密度依赖需要的结果。

    (5) 将生物反应器接到旋转平台上。

    (6) 调整生物反应器的转速，使得支持材料和细胞保持静态悬浮状态。

    (7) 把生物反应器放进 3 7 ℃ 、 9 5 % 〜 100% 湿 度 的 C O 2 孵箱中。

    (8) 24 h 更换培养基，移去未贴壁细胞。

    (9) 以后间隔 48 h 要完全更换培养基

    ​

    来源：丁香实验

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