胚 胎 来 源 的 软 骨 细 胞

胚 胎 来 源 的 软 骨 细 胞

骨 髓 间 充 质 来 源 的 软 骨 细 胞

骨 膜 来 源 的 软 骨 细 胞

软 骨 细 胞 的 培 养 、特 征 鉴 定

种子细胞和支架材料的三维动态培养

通 常情况下，将细胞置于培养瓶、孔板或者不具有三维结构的膜性材料上培养是二维培养，细胞只目 Ii 形成薄层培养物，不目旨够构建成二维结构的组织。软骨细胞在这种培养方式中短期可以维持一定的表型稳定，长期传代培养时就会出现反分化现象。近来研究表 明，三维立体的培养有利于软骨细胞的增殖、分化和表型的保持稳定，甚至能使在二维培养中反分化的软骨细胞重新返回原代细胞的高分化状态。这是因为三维立体 的环境更接近细胞在体内的情况，三维立体的空间为维系细胞的代谢活动提供了适宜的微环境 ，更有利于细胞之间，细胞和环境之间的信号传递，从而可以充分发挥对细胞增殖、分化和代谢的调节作用。现在软骨细胞的三维培养已经成为体外研究的主流。

材 料 的 准 备

细 胞 的 种 植

1) 沉淀法

这是最为常用的方法。种 植 浓 度 可 达 7xl0⁴——15xl0⁴ 个/mm3 基质材料。将已预湿的支架材料置于培养皿中，制备高密度的细胞悬液。用移液管将 25〜 50um 的细胞悬液缓慢逐滴滴入材料上， IOmin 后将材料轻轻翻转，再将另一半 25〜 50um 的细胞悬液加入。此外 ，也可以用细微的注射针头将细胞注入材料中。上述种植法的缺点是细胞在材料上的分布可能不均匀 (Freed etal. 1993)。

2) 真空吸附法

将 已预湿的支架材料置于培养皿中，制备高密度的细胞悬液。用移液管将细胞悬液滴加于材料上，将整个培养皿置于负压容器中，反 复 抽 吸 空 气 造 真 空 负 压 ，迫使细胞进入吸附于材料的内外部。 2 h 细胞黏附后小心加入基本培养基， 24 h 后再加入完全培养基 。

这种静态种植方法的种植效率往往不超过 5 0 % 〜 7 0 % ，细胞在支架上的分布也不是很均勻的，通常支架的外围有更高的细胞密(Ponticiello et al.2000)。

动态细胞种植

将支架材料浸没在高密度细胞悬液中，采用旋转系统，使细胞更多更均匀地黏附于支架材料上。

很 多动态种植技术都用静止型旋转瓶作为旋转系统，旋转瓶塞下穿插有一根或几根细长针，支架材料穿挂在细长针上，通过底部的磁力搅拌器搅动瓶底的小铁转子带动 液体的旋转流动，经过几个小时旋转流动，细胞将会很均匀地黏附于材料上 (Vunjak et al.1999)(图 9.1〜 图 9.3)。

细 胞 材 料 三 维 培 养

进行细胞材料的三维培养，必须应用特殊的培养容器。 目前常见有三种培养器：
1) 静止型旋转瓶

这种旋转瓶主体是静止不动的，在旋转瓶底部里放置有磁力棒，整个装置放在磁力搅拌器上，通过电磁揽拌就可以带动旋转瓶中液体的旋转流动。在旋转瓶塞口下插有一根或多根细长针，支架材料就固定于这些细长针上，旋转瓶的两侧伸出两个角作为换液或通气口。

2) 转动型反应器

旋 主 体 固 定 于 一 个 底 座 上 ，随着底座一起转动，容器的中部放置细胞和材料。如美国宇航局生命中心研制的旋转培养系统 (RCCS)。该系统的圆柱状培养容器中放置细胞或组织材料培养液充满整个容器。整个容器由电机驱动沿着水平轴旋转。培养液、细胞和支架材料随着容器一起 旋转而不与容器壁和其他部件相触，细胞始终维持在自由落体的培养状态。

3) 灌流型培养器

一 灌流培养器的种类较多，设计比较复杂。培养液以一定速度流入反应器，同时又以相同速度从反应器中流出，而其中培养的细胞和材料载体则被截留在反应器内而不 随培养液一起流出。它的特点是不断地加入新鲜培养基以及不断地抽走含细胞代谢废物的消耗 培养基，使 细胞得以在一个相对稳定的生长环境内生长增殖。近年来已经有研究人员，该系统培养软骨细胞与支架材料的复合体。结果显示软骨细胞与支架培养复合体在灌注培 养系统内培养 5 0 天 ，再造软骨的组织学和力学特征均与天然软骨相似。

下面以静止型旋转瓶和旋转反应器细胞培养系统为例，描述软骨组织的三维培养。

(1) P G A 材料制成一定大小形状，环氧乙烷灭菌处理，用培养基预湿处理，固定于胃止型旋转瓶或旋转反应器中。

(2) 培养瓶中加入 I2Ocm³的培养基，于 37℃ 、 5 % C O 2 培养箱预置 8—— 12 h。

(3) 软骨细胞接种密度为 4xl0⁵〜 5xl0⁵个/c m 3 培养基，静止型旋转瓶电磁搅拌速度为5 〇 〜 SOr/min，旋转反应器旋转速度为 15r/min。 2 处内几乎所有细胞都发生附着。

(4) 培 养 3 天 后 ，静止型旋转瓶中的细胞材料复合体仍以 50〜 80r/m i n 搅拌速度培养，每隔—天半量更换培养基，连续培养 8 周 。旋转反应器培养则速度从 15r/m i n 到 28r/min逐渐增加，每隔一天全量更换培养基，连续培养 4 周 。

三 维 培 养 组 织 评 测

扫 描 电 镜 观 察

取 出培养器中细胞材料复合物， P B S 清 洗 ， 2 % —— 3 % 戊 二 醛 4 1 固 定 l——2 h ， P B S 清洗 2 次 ， 1 % 四 氧 化 锇 代 固 定 lh， P B S 清 洗 2 次 ，乙醇梯度脱水，临界点干燥，离子溅射仪喷金，扫描电镜处理观察细胞材料复合物。

2 组 织 学 形 态 观 察

苏木素-伊红 (H E ) 和番红精-孔雀绿 (Safranin O-Fast green) 染色是观察软骨组织常用的染色方法 (杨 志 明 2 0 0 2 ; 司 徒 镇 强 等 2004)。

苏木素-伊红 (H E ) 染色

1 ) 试剂配制

(1) 苏木素：用滤网过滤后放入染缸。

(2) 伊 红 ： 0.5 g 溶 于 IOOmI 去离子水中。

(3) 盐酸乙醇溶液：用 7 5 % 乙醇配成 1 % 盐酸。

(4) 稀氨水： 200m l 去离子水中加入 2——3 滴浓氨水。

2 ) 染色步骤

(1) 石蜡切片浸入二甲苯脱蜡， 20 min/次 x2 。

(2) 经 1 〇〇%、 9 5 % 乙醇各 2 次 ， 9 0 % 、 8 0 % 、 7 0 % 乙 醇 1 次 ，逐级水化，每 次 3——5 min。

(3) 苏木素染液染色 5〜 IOmin, 自来水浸洗。

(4) 盐酸乙醇溶液分色数秒，自来水浸洗。

(5) 氨水浸洗数分钟，组织胞核蓝化后，自来水浸洗。

(6) 伊 红 浸 染 5〜 IOmin, 自来水冲洗 5〜 15 m i n 。

(7) 经 7 0 % 、 8 0 % 、 9 0 % 乙醇各一次， 9 5 % 乙 醇 2 次 ， 100% 乙 醇 3 次逐级脱水，每次 lmin。

(8) 二甲苯透明 3 次 ，每 次 lmin。

(9) 中性树脂封片，镜检。

番红精-孔雀绿 (Safranin O- Fast green) 染色

1 ) 试剂配制

⑴ Safranin O 染液 ： IOOml 去离子水中加入 0.2 g Safranin O ， Iml 无水乙酸。

⑵ Fast green 染 液 ： I O O m l 去离子水中加入 0.2 g Fast green， I m l 无水乙酸，配成储存液。染色时取上述储存液按 1 :5 用去离子水稀释。

2 ) 染色步骤

(1) 石赌切片干燥、脱蜡、水 化同 H E 染色步骤。

(2) Safranin O 染色：浸 入 Safranin O 染 液 IOmin，去离子水漂洗 2 min。

(3) Fast g r e e n 染 色 ：浸 入 Fast g r e e n 染 液 1 0 —— 1 5 s ， 去离子水漂洗 l——2 min。

⑷ 脱 水 、透明和封片同上。

细 胞 增 殖 测 定

取出培养器中的细胞材料复合物， 0.25% 胰 蛋 白 酶 37℃ 消 化 ，计数观察细胞增殖情 况 。

细 胞 D N A 合 成 测 定

胸 腺嘧啶核苷 ( T d R ) 是 D N A 合成的必需物质，用 同 位 素 3 H 标 记 T d R ( 3 H - T d R ) 作为D N A 合成的前体掺入 D N A 合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，反映细胞 D N A合成代塘 T 及细胞增殖的情况 (司徒镇强等 2 0 0 4)。

1 ) 试剂材料

(1) 含 10% F B S 的培养液， H B S S 缓冲液。

⑵ 3.7xl0⁸Bq/mI H B S S 配制的 3 H -T d R 0

(3) 1 0 % 三氯醋酸 (T C A )，甲醇。

⑷ 0.3 Eq 1 % SDS 配制的 N a O H 。

(5) 闪烁液、液体闪烁计数仪。

2 ) 步骤

⑴ 取 对 数 生 长 期 细 胞 ，制 成 3xl0⁵ 个/m l 的细胞悬液，每 孔 Iml 接 种 于 2 4 孔 板 ，37 ℃ 、 5 % C O 2 饱和湿度环境培养一定时间。

(2) 在细胞处于对数生长期时，每 孔 加 1 0 0 ul ³ H - T d R t3 根据实验要求继续培养 1〜 2 4 h 。

(3) 终止培养，小心吸弃上清，用 H B S S 漂洗细胞 2 次, 然后加 2m l 预 冷 的 10% T C A ，放 置 lOmin。如果细胞松散，应先用甲醇固定 lOmin。

⑷ 用 10% T C A 重 复 洗 2 次 ，每 次 5 min。

(5) 每孔加 0.5ml0.3 Eq NaOH 于 60℃ 处理 3 〇min，然后冷至室温。

(6) 收集裂解液于闪烁瓶中，加 5ml 闪烁液，用液体闪烁计数仪测定每分脉冲数( c p m ) ， 结 果 以 c p m / 1 0 ⁶ 表示