干细胞与肌腱组织工程

 

人 胚 肌 腱 细 胞 的 分 离 培 养 294

兔 肌 腱 细 胞 的 分 离 培 养

肌 腱 细 胞 的 形 态 特 征 及 鉴 定

1 ) 细胞形态

刚分离出的人腱细胞呈圆形，有很强的折光性。 48 h 后大部分细胞贴壁，贴壁生长后形态呈梭形，细胞两极突起较长 (杨 志 明 2004)。
2 ) 特征鉴定

肌腱是由胶原束、肌腱胶质和肌腱细胞组成，具 有 j 型胶原的合成能力，因此可以检 测 I 型胶原和胶原的特征蛋白轻脯氨酸来鉴定 (项 舟 等 2 〇〇〇)。

(1) 经脯氨酸含量测定：选择原代或传代细胞，每 代 以 10 瓶为一组，定量接种细胞及加入培养基培养 7 天 ，完全培养基为空白对照组。用自动生化分析仪测定培养液中的羟脯氨酸含量。

(2) I 型胶原检测：将传代的肌腱细胞种于放有载玻片的培养瓶中做成细胞爬片，培养一周后用免疫细胞化学的方法对 I 型胶原进行染色鉴定。

肌 腱 细 胞 和 支 架 材 料 的 复 合 培 养

复合支架材料的研究已取得了一定的进展，但仍然不能确定哪一种材料最适合肌腱的组织工程化应用。下面我们以 PG A 为支架材料描述 Leghorn 鸡肌腱细胞和材料复合培养实验技术。

试 剂 材 料

DMEM 培养基、 1 0 % 新生小牛血清、 l 〇〇 U/ml 青霉素、 lOO^g/ml 链霉素、 P B S 缓冲液、0.25% II 型胶原酶、0.25% 胰蛋白酶、PGA 支架材料、Maxon 可吸收缝合线、Leghorn 鸡。

方法

c. 1 % 锇 酸 固 定 液 代 固 定 2 h ， P B S 冲 洗 3 遍 。 -
d. 5 0 % 、 7 0 % 、 8 0 % 、 9 0 % 、 9 5 % 梯度乙醇逐级脱水。
e. 临界点干燥、喷金，扫描电镜观察。

动 物 实 验

(1) 取 1 2 月龄雌性 Leghorn 鸡 2 0 只 ， 2.5% 戊巴比妥钠麻醉，常规消毒。

(2) 将每只鸡左右两侧足第二趾深屈肌腱切断，并造成缺损，约 1.5c m 长 。

(3) 用体外构建的组织工程化肌腱桥接缺损区，断 端 用 5-0 无创伤肌腱缝合线做改良Kessler 法缝合。

⑷ 术 后 第 二 趾 屈 曲 位 固 定 5 天 。分笼饲养，自由进食。分别于术后 2 周 、 4 周 、 6周 、 8 周取材制备标本。

检 测 方 法

扫 描 电 镜 观 察

同前。观察支架材料复合细胞前后形态变化。

组 织 学 观 察

将 标 本 用 1 0 % 中性福尔马林液固定，石蜡包埋，切 片 ， H E 染色 和 Masson trichrome染色进行组织学变化观察。

Masson trichrome 染色方法：

(1) 常规将切片脱蜡至水。

(2) 人 1 % 丽春红染液 3 min。

(3) 1 % 乙酸水溶液分色。

(4) 1 % 磷钼酸水溶液染 5m i n 后入蒸馏水洗。

(5) 1 % 甲基蓝染液 2 min，入蒸馏水洗。

(6) 梯度乙醇快速脱水。

(7) 二甲苯透明，中性树胶封固。

生 物 力 学 测 定

采 用 I N S T R O N 生物力学测定仪测定肌腱组织的抗拉力。在室温、生理盐水润湿条件 下 ，测定其抗拉强度、最大断裂能量和最大断裂应变。加载速度为 5 mm/min， 载荷下降 9 0 % 时停止加载。每标本测试前均以 I N 反 复 牵 拉 10 次 ，使标本较原来长度延长〇 5 m m左右以预调。

I 型 肢 原 含 量 测 定

用免疫组织化学方法。

(1) 石蜡切片常规脱蜡

(2) 0.3% 过氧化氢孵育 5 min。

⑶ 蒸 馏 水 冲 洗 2 次 ，每 次 5 min。

⑷ 5 % 正常山羊血清室温封闭 lOmin。

(5) 彳顷去血清，加入兔抗鸡 I 型胶原抗体 4℃孵育过夜。

(6) PBS 冲 洗 3 次 ，每 次 5 min。

(7) 滴加生物素标记的二抗，孵 育 30 min。

(8) PB S 冲 洗 3 次 ，每 次 5 min。

(9) 辣根过氧化物酶标记的连霉卵白素孵育 lOmin。

(10)PBS冲 洗 3 次 ，每次 5min。

(11) D A B 显色，苏木素复染封片