干细胞与皮肤组织工程

干细胞与皮肤组织工程

皮 肤 细 胞 培 养

试 剂 材 料

成 纤 维 细 胞 的 分 离 培 养

成纤维细胞体外培养技术已经很成熟。常用培养方法有组织块贴瓶法和酶消化法。组织块贴瓶法进行原代培养时是把小的皮肤块植于培养瓶 (皿) 壁上，当组织周边沿生的细胞相互接触形成单层时，消化这些细胞后获得原代细胞；酶消化培养法是先用消化酶如胶原酶、胰蛋白酶等对组织进行消化后获得单细胞悬液，然后接种获得原代细胞。组织块培养难以贴瓶，轻微振动会使组织块不易贴壁，培养基的波动作用也会影响组织块培养。下面我们介绍成纤维细胞的酶消化培养法。

(1) 取人环切包皮，去除皮下组织，乙醇消毒，用 P B S 漂洗几次。

角 质 形 成 细 胞 的 分 离 培 养 (Medalie et al. 1999, Boyce et al. 1999)

黑 色 素 细 胞 的 分 离 培 养 (Hsuet al. 1996)

(1) 用前面同样方法将表皮与真皮分离。

(2) 收集表皮， 0.25% 胰 酶 消 化 lOmin，反复吹打以获得单细胞悬液

(3) 用角质形成细胞培养基接种培养 3 天 ，然后将培养液更换为黑色素细胞培养液。

⑷ 每 2〜 3 天换液一次。原代细胞长满 7 0 % 〜 8 0 % 时 ，胰酶消化传代。

黑 色 素 细 胞 的 鉴 定

一般培养 2 天后即可看见黑色素细胞，细胞呈梭形或多角形，呈现树突状，随着生长更为明显。

黑色素细胞能够产生黑色素，多巴胺染色可见细胞质内呈现黑色或灰色颗粒，透射电镜观察也可看见细胞质内有黑色素颗粒。

皮 肤 组 织 工 程 支 架 材 料

皮肤目前常用的支架材料主要有以下几种：成纤维细胞等饲养层细胞；聚乌拉坦、聚乳酸等合成材料；胶原、透明质酸、纤维蛋白胶等细胞外基质；脱细胞真皮等。脱细胞真皮已经商业化，如 AlloDerm、 Integra 等 。脱细胞真皮有多种制备方法，下面介绍一下常用脱细胞真皮的制作方法。

冻 融 法 制 作 脱 细 胞 真 皮

1 ) 方法一
(1) 将前面所述分离的真皮切成大小适中的小块

化 学 试 剂 消 化 酶 混 合 法 制 作 脱 细 胞 真 皮 (杨 志 明 2002)

复合皮肤构建 (鄂征等 2003, M e d a l i e e t a l.1999)

角 质 形 成 细 胞 -脱 细 胞 真 皮 皮 肤 的 构 建

(1) 将脱细胞真皮放入组织培养皿中，真皮乳头面朝上，加入少量培养液， 37℃ 培养 Ih

(2) 将角质形成细胞用胰蛋白酶消化离心，洗涤后轻轻滴种于真皮块上， 37℃; 孵育2 h 使细胞贴壁，随后加入培养基浸没角质形成细胞_脱细胞真皮复合物。此 后 每 3 天换液一次。

(3) 浸没培养角质形成细胞-脱细胞真皮复合物 3 天后，用玻璃器具或其他无菌不锈钢器具：将复合物轻轻托起，离开培养皿底。慢慢加入新鲜培养液，以和复合物表面平齐不超过为准，将角质形成细胞层暴露于空气中，形成气_液培养界面层。

(4) 如 此 培 养 至 少 1 周 ，将会在真皮乳头面上形成一个具有多层角质形成细胞的上皮膜。此复合皮肤可以进行动物移植。

角 质 形 成 细 胞 _黑 色 素 细 胞 - 真 皮 替 代 物 复 合 皮 肤 的 构 建

真皮替代物现在种类比较多，例如，聚乳聚羟基乙酸共聚物 (P L G A )、胶原凝胶、胶原-黏多糖海绵和胶原冻干膜等。我们以胶原为例介绍复合皮肤的构建。

动 物 移 植 试 验

(I) BALB/c 裸 鼠 ， 2 % 戊巴比妥钠 (30〜 50 mg/kg) 腹腔注射麻醉

⑵ 7 0 % 乙醇擦洗鼠背，随后再用聚维酮碘 (Betadine) 消毒。

(3) 在裸鼠背部切取全层皮作圆形创面 (区域要小于待移植的复合皮肤) 以供皮肤移植。

(4) 取上述组织工程化的复合皮肤，覆盖创面，用 6-0 线缝合，加压包扎。

(5) 移 植 6 周后基本上已能长出完全分化、具有色素上皮和表皮基底层的皮肤组织来。