骨组织工程的种子细胞中的干细胞的分离培养

骨组织工程的种子细胞中的干细胞的分离培养

骨 髓 来 源 的 间 充 质 干 细 胞

同 4.2 中的步骤。

脂 肪 来 源 的 间 充 质 干 细 胞 ( 以 大 鼠 为 例 )(Zuk et al.2001)

1 ) 器械

烧杯、组织剪、镊子、眼科剪、眼科镊、培养皿、 50m l 离心管、 I O m l 离心管、 80目筛网、 2 0 0 目筛网、摇床、离心、机 、孵箱、 25m l 的培养瓶、吸管、倒置显微镜。

2 ) 试剂

PBS(phosphate buffer solution)、D-Hank 缓 冲 液 、0.2% 的 I 型 胶 原 酶 、2% 的 BSA(bovineserum albumin)、 7 5 % 乙醇、红细胞裂解 液 、 L-DMEM(含 10% 胎牛血清、 1% 双抗)。

3 ) 步驟

(1) 脱白法处死雄性大鼠， 7 5 % 乙 醇 浸 泡 5 min，无菌条件下剖开腹部，找到睾丸，在附睾部位有一小块脂肪组织，用眼科剪将脂肪组织剪下，注意尽量不要带有血管。

⑵ 用 PB S 或 者 D-Hank 缓冲液浸洗 2 遍 ，尽量洗去血液。

(3) 在平皿中加入一吸管的 D -H a n k 缓冲液，用眼科剪将脂肪组织剪成大小约 I m m 3的组织块。

⑷将剪碎的组织块连同液体一同加入 50m l 的离心管，加人同体积的浓度为〇.2%的 I 型 胶 原 酶 并 加 入 半 体 积 浓 度 为 2 % 的 B S A ，用封口膜将管口封好，放 人 3 7 ℃ 的摇床 中 ，摇床的速度为 120r/min，消 化 40 min。

(5)取 出 离 心 管 ，用 7 5 % 乙醇彻底消毒，将离心管中的液体依次通过 8 0 目和 2 〇 0 目的滤网。

(6) 将过滤后所得的液体加入红细胞裂解液，静 置 IOmin，然 后 以 1200 g 的速度离心5 min。后弃上清液，用 D -H ank 缓 冲液或者 P B S 重悬，然 后 以 1200 g 的速度离心 5 min后弃上清液，重复一次。

(7) 将所得的细胞用含有 10% 胎 牛 血 清 及 1% 双 抗 的 L -D M E M 培养基吹打俾细胞分散成单细胞悬液。然后接种入两个 25m l 的培养瓶，并 放 入 37℃、 5 % C O 2，饱和湿度的孵箱中培养。注 意 在 48 h 内不要晃动培养瓶，使细胞充分贴壁。

(8) 4 8 h 后更换培养基，以 后 每 3 天更换一次培养基，等到细胞铺满培养瓶底 80%的时候，开始传代。

支 架 材 料 的 选 择

理想的骨组织工程的支架材料应满足以下要求 (鄂 征 等 2003):
⑴ 良 好 的 生 物 相 容 性 ：除满足生物材料的一般要求，如无毒、无 致 畸 作 用 外 其降解产物应对细胞无毒害作用，不引起炎症反应。

(2) 良好的生物降解性：材料的降解率应与新生组织的生长率相适应，降解时间应能根据新生组织的生长特性做人为调控。

(3) 具有三维内联多孔结构：孔隙率最好达到 6 〇% 以上，具有较高的面积体积比，利于血管和神经的长入，有利于细胞的黏附生长，细胞外基质沉积，营养和氧气进入和代谢产物的排出。

⑷ 易 加 工 、易塑形、临床使用方便。

(5) 有一定的机械强度和韧性，满足临床应用的需要。

(6) 材料的表面有利于细胞的黏附生长，利于细胞的分化。

目前研究中应用较多的有生物活性陶瓷，人工可降解聚合物和天然材料三大类，而多种成分的复合型材料今年越来越成为研究的热点。

⑴ 生 物 陶 瓷 ，如羟基憐灰石 (HA) 和磷酸三钙 (TCP) 等。

(2) 人工合成的可降解聚合物，如聚乳酸 (PLA) 和聚羟基乙酸 (PGA) 以及其两者的共聚 物 PLGA，聚 丁 酸 (PHB) 及 其 与 聚 经 基 戊 酸 (PHV) 的 共 聚 物 pH B V ，聚 酯 脲 烷(polyestemrethane)，聚酸酐等。

(3) 天然材料，如胶原、甲壳素及其衍生物、藻酸盐、纤维蛋白、天然珊瑚等。

⑷ 复合材料 ，如耗磷陶瓷/胶原复合材(collagen_hydroxylapatite， CHA)、胶原/高分子聚合物复合材料、钙磷陶瓷/高分子聚合物复合材料等。

细 胞 与 支 架 材 料 的 复 合

细胞与支架材料的复合方法根据材料的不同而不同 (Kim et al.2005)。下 面以 PLGA及骨髓间充质干细胞为例来介绍细胞与支架材料的复合方法。

1 ) 器械

镊子、眼科剪、眼科镊、培养皿、孵箱、计数板、吸管、倒置显微镜
。
2 ) 试剂及材料

PBS、 L-DMEM(含 10% 胎牛血清及 1 % 双抗)、〇. 〇 2%EDTA、 0.25% 的胰酶、 PLGA、0.25% 戊二酸、无水乙醇、胎牛血清。

3 ) 步骤

(1) 将支架材料切割成合适大小。

(2) 钴源照射消毒。

⑶ 将 支 架 材 料 放 入 含 双 抗 的 L -D M E M 中浸泡 3 天 后 ，吸去培养基，P B S 冲 洗 3 遍 。

⑷ 将 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 用 含 0.02% E D T A 、 0.25% 的胰酶消化，计数。

(5)将 细 胞 悬 液 调 整 浓 度 为 1.oxio⁵ 个/mi。

(6) 取适量的单细胞悬液滴于 P L G A 支架材料上， 37℃、 5 % C O 2 条件下培 6 h 后补加 L - D M E M 2m l ，并加入胎牛血清，使其最终浓度为 1 5 % 。

(7) 常 规 3 天换液一次。

(8) 1 周后吸去培养基， PBS 洗 涤 3 遍 ， 0.25% 戊二醛固定，无水乙醇脱水，自然风干喷金，扫描电镜观察。

诱 导 分 化

骨 髓 间 充 质 干 细 胞

1) 诱导培养基的成分含 有 10% 胎牛血清，1 % 双抗的 L -D M E M 另外加入 O.lpmol/L 地塞米松，50umol/L L -抗血酸-2-磷酸酯， 10m m 〇 l/L ，磷酸甘油。

2 ) 器械

IOml 离心、管 、离心机、孵箱、 25m l 的培养瓶、吸管、计数板、倒置显微镜、 9 6 孔培养板、 2 0 0 0 的枪及枪头。

3 ) 试剂

P B S 、 L -D M E M 、胎牛血清、双抗、〇. 〇 2%E D T A 、 0.25% 的胰酶。

4 ) 步驟

⑴骨髓间充质干细胞常规胰酶消化，计数。

(2) 用 普 通 的 含 有 1 0 % 胎 牛 血 清 ， 1 % 双 抗 的 L - D M E M 培养基调整细胞浓度为IO⁵ 个 /ml。

(3) 按 每 孔 1 0 0 0 的量接种人 9 6 孔板。

(4) 24 h 后更换为诱导培养基。

(5) 每 3 天更换培养液一次， 3 周后进行成骨细胞的检测。

脂肪来源的间充质干细胞

目前脂肪来源的间充质干细胞向成骨细胞的诱导分化大多参照骨髓来源的间充质干细胞进行 (Zuketal.2001)

观 察 及 检 测

骨髓间充质干细胞及脂肪来源的间充质干细胞在诱导培养基的诱导下，在培养一周左 右 ，可观察到少许细胞由梭形变成多角形。随着时间的增长，多角形的细胞逐渐增多并聚集成团形成细胞结节。

成 骨 细 胞 的 主 要 功 能 是 合 成 分 泌 骨 基 质 ，并 促 进 基 质 矿 化 形 成 骨 组 织 (鄂征等2003)。 目前，对成骨细胞来说，比较特异性的指标有： I 型胶原、碱性磷酸酶、矿化结 节 。

I 型 肢 原 的 检 测

1 ) 组织化学的方法

将细胞培养在盖玻片上，同 Masson 染色的方法，观察胶原的分布。胶原染为蓝色，细胞质染成蓝褐色。

2 ) 免疫组化的方法 (杨 志 明 2004)

⑴ 细 胞 爬 片 或 冰 冻 切 片 P B S 洗 2 次 ，每 次 3 min。

(2) 4 % 多聚甲醛室温固定 30 min。

(3) P B S 室温洗涤 2 次 ，每 次 3 min。

⑷ 用 含 0.1% Triton X -100、 0.3% 双氧水-甲醇的溶液室温封闭 30 min。

(5)蒸 馏 水 冲 洗 ， P B S 浸 泡 5 min。

(6) 1 0 % 山羊血清的 P B S 缓冲液 (p H 7.2) 室 温 孵 育 lh。

(7) 4 % 的胃蛋白酶浸泡 lh。

(8) 分另 Ij 加入一抗为 I 型胶原单克隆抗体工作液 50 ul

(9) P B S 缓冲液洗涤 3 次 ，每 次 5 min。

(10) 滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液， 3 7 ℃ 孵 育 15 min。

(11) P B S 缓冲液洗涤 3 次 ，每 次 5min。

(12) 滴 加 含 0.05%DAB、 0.03% 双氧水的 0.01mol/LTris.HCl缓冲液显色 1 〇 min。

(13) 流水冲洗 5 min

(14) 阴性对照试验用 0.01mol/L P B S 代替一抗进行免疫组化染色。

(15) 显微镜下观察试验结果。

成骨诱导 2 1 天 ，免疫组化 S P 法可检测到 I 型胶原的表达，在结节周围呈黄褐色。

碱 性 磷 酸 酶

钙钴法

甲醛-钙固定液： 4 % 甲醛液 5m l 加 入 IgCaCl2 溶 于 45m l 水中。孵育底液： 2 % 甘油 磷 酸 钠 l 〇 ml、 2 % 巴比妥钠 10 ml、 2 % CaCl210 ml、 2 % 的硫酸镁 Iml 加 入 5m l 蒸馏水中。

步骤

(1) 细胞爬片固定： 4℃甲醛钙液固定 2 h 。

(2) PBS 洗 2 遍 ，每次 5 min。

(3) 加入孵育底液 37℃孵 育 1.5 h 后蒸馏水室温冲洗 1〜 2 min。

⑷ 2 % 硝酸钴内浸泡 2 min。

(5) 蒸馏水常温冲洗 2 min。

(6) 1 % 硫 化 铵 洗 lmin，自来水冲洗，自然干燥，封固。

(7) 观察结果。

碱性磷酸酶阳性的细胞呈褐色至黑色。诱导的第 7 天可见到碱性磷酸酶呈弱阳性反应 ，第 14 天呈强阳性反应。

偶氮耦联法

孵育底液的配制：萘 酚 A S -B I 磷 酸 盐 20m g 、 D M S O 0.5 ml、六偶氮副品红 0.5m l 溶人 50 ml 0.2%mol/L 巴比妥乙酸冲液 (pH9.2)50 ml。

步骤

⑴ 细 胞 爬 片 1 0 % 甲醛溶液中固定 l O m i n G t )。

(2) 蒸馏水冲洗。

(3) 将过滤后的孵育底液滴加于细胞爬片上。室温下作用 45 min。

(4) 流水冲洗，晾干。

(5) 甘油明胶封固。

胞质中可见红色的碱性磷酸酶阳性颗粒。

矿 化 结 节 染 色

茜红素法

步驟

⑴ 培 养 皿 中 P B S 冲 洗 2 遍 ， 9 5 % 乙醇固定 lOmin。

⑵ 蒸 馏 水 洗 3 次 。

(4) 蒸馏水冲洗，干燥后封固。

染料的品种不同，矿化结节成不同的红色。

von Kossa 染色

步骤

(1) P B S 洗细胞爬片 3 次 ，每 次 2 min。

(2) 中性福尔马林液室温固定 5 min。

(3) 室温下蒸馏水洗涤 2 次 。

(4) 5 % 硝酸银浸泡 2 h 。

(5) 紫 外 光 照 lh。

(6) 室温下蒸馏水冲洗 2 min。

(7) 5 % 硫代硫酸钠中和残留的锇硝酸银。

(8) 干燥封片。

(9) 显微镜下观察结果。