组织切片的 TUNEL 染色

① 组织

② 甲醛

③ NaOH

④ PBS

⑤ 二甲苯

⑥ 乙醇

⑦ 蛋白酶

⑧ K Tris-HCl 溶液

⑨ Parafilm 膜

1、取下组织，立即用新制备的 4% 甲醛固定，室温过夜。用多聚甲醛制备 4% 的甲醛溶液，在 100 ml 水中加 8 g 多聚甲醛，在通风橱中加热至 50~60 ℃，加几滴 1 mol/L NaOH 使固体全部溶解。多聚甲醛全部溶解后，将溶液放冰上，迅速冷却至室温。加 100 ml pH 7.2 的 2 x PBS，过滤固定液。甲醛储存液应在每次实验前新配。

2、通过 50%、70%、80%、95%、100% 乙醇和 100% 二甲苯系列孵育使组织脱水。

3、用石蜡包埋组织，制备 5 μm 厚的切片，固定于玻片上。将石蜡切片 70 ℃ 加热 10 分钟或 58~60 ℃ 加热 30 分钟去除石蜡。

4、通过以下溶液进行系列转移水合切片：二甲苯 5 分钟 2 次，96% 乙醇 3 分钟 2 次，然后 90%、80%、70%、50%，双蒸水各 3 分钟。

5、在冷的 4% 甲醛中后续固定切片 5 分钟，用 pH 7.2 的 PBS 清洗 3 次，每次 5 分钟。

6、室温下用 1~2 μg/ml 蛋白酶 K 的 10 mmol/L Tris-HCl 溶液（pH 8.0）处理玻片 10 分钟，用 PBS 清洗 3 次。

7、用 0.5% H₂O₂ 的 PBS 溶液室温处理 20 分钟，封闭内源过氧化物酶活性。

8、用补充有 150 mmol/L NaCl 和 0.05% BSA 的 TdT 反应缓冲液预孵育切片。每个切片上加 27 μl 溶液，用已裁成合适大小的 Parafilm 膜覆盖。

9、室温孵育 10 分钟后，取下 Parafilm 膜，用纸巾吸去水。

10、在用 TdT 反应缓冲液制备的 200 U/ml TdT 酶、2~4 μmol/L 地高辛配基偶联的 dUTP 中孵育切片，再用 Parafilm 膜覆盖切片，37 ℃ 温室中 30 分钟~1 小时。用 pH 7.2 的 PBS 将切片洗 3 次。

11、用 5 U/ml 辣根过氧化物酶偶联的抗地高辛孵育玻片，用 Parafilm 膜覆盖。37 ℃ 温室中孵育 30 分钟。

12、应用快速 DAB 底物，用 DAB 和 H₂O₂ 处理检测标记细胞，用过量水清洗切片。可用甲基绿复染切片 30 秒。用过量水清洗。

13、通过用二甲苯终洗 2 次的系列乙醇使切片脱水。

1、湿盒用带盖方盘，里面固定几根玻璃吸管用于放玻片，使用时稍加水即可。

2、英文说明书中对组织细胞通透这一步中，加了「对难处理的组织的处理」，意思是用常规方法处理（如蛋白酶 K) 后，应该阳性而做不出阳性时，可用微波修复。

3、复染的目的是为了衬托组织形态结构，以利于结果分析，石蜡切片常用苏木素，核染成兰色，冷冻切片常用甲基绿，核染成绿色。

4、蛋白酶 K 消化蛋白后，需要用封闭液。