材料与仪器
ES 生长培养基 neoR-MEF 滋养板 96 孔 U-底板 无菌吸头 微量移液器
步骤
1. 准备下列试剂和材料：
ES 生长培养基，含 300 μg/ml G418 和青霉素/链霉素
96 孔平底 neoR-MEF 滋养板
96 孔 U-底板
细而圆的无菌吸头
微量移液器（10~100 μl）
8 道移液器
无菌多道移液器容器
2. 在有 neoR-MEF 滋养层的平底 96 孔板的每孔中加 150 μl 含 G418 和青霉素/链霉素的 ES 培养基。置温箱待用。
3. 在生物安全柜内的倒置显微镜下挑取克隆。
4. 用多道微量移液器在 96 孔 U 底板每孔加 25 μl 胰酶溶液。
5. PBS 冲洗含 ES 克隆的 100 mm 培养板两次。加 PBS，恰好没过培养板的底。
6. 在显微镜下，用装有无菌超细吸头的微量移液器挑取 ES 克隆。破坏 ES 克隆周围的 MEF 细胞，将克隆吸入吸头，体积不要超过 20 μl。
7. 克隆放入含胰酶的 96 孔培养板。
8. 多道移液器吹吸 4 次，分散 ES 细胞，转移到从温箱中取出的 96 孔 neoR-MEF 滋养板，孵育过夜。
9. 第二天换含 G418 和青霉素/链霉素的 ES 生长培养基，继续孵育。
10. 细胞培养 5 天左右传代。每天更换含 G418 和青霉素/链霉素的培养基。
ES 生长培养基，含 300 μg/ml G418 和青霉素/链霉素
96 孔平底 neoR-MEF 滋养板
96 孔 U-底板
细而圆的无菌吸头
微量移液器（10~100 μl）
8 道移液器
无菌多道移液器容器
2. 在有 neoR-MEF 滋养层的平底 96 孔板的每孔中加 150 μl 含 G418 和青霉素/链霉素的 ES 培养基。置温箱待用。
3. 在生物安全柜内的倒置显微镜下挑取克隆。
4. 用多道微量移液器在 96 孔 U 底板每孔加 25 μl 胰酶溶液。
5. PBS 冲洗含 ES 克隆的 100 mm 培养板两次。加 PBS，恰好没过培养板的底。
6. 在显微镜下，用装有无菌超细吸头的微量移液器挑取 ES 克隆。破坏 ES 克隆周围的 MEF 细胞，将克隆吸入吸头，体积不要超过 20 μl。
7. 克隆放入含胰酶的 96 孔培养板。
8. 多道移液器吹吸 4 次，分散 ES 细胞，转移到从温箱中取出的 96 孔 neoR-MEF 滋养板，孵育过夜。
9. 第二天换含 G418 和青霉素/链霉素的 ES 生长培养基，继续孵育。
10. 细胞培养 5 天左右传代。每天更换含 G418 和青霉素/链霉素的培养基。
来源：丁香实验
