分配96孔板上细胞用于冻存和体外分化

DMSO PBS 胰酶溶液 冻存液
平底 96 孔板 移液器 ES 生长培养基 ES 分化培养基

1. 准备下列试剂和材料：

DMSO（组织培养级）

平底 96 孔板

多道移液器

无菌多道移液器容器

ES 生长培养基

ES 分化培养基

无 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ PBS

胰酶溶液

2X 冻存液

2. PBS 冲洗 96 孔板上的 ES 细胞两次，200 μl/孔。

3. 每孔中 40 μl 胰酶溶液，37℃ 孵育 5 分钟。显微镜下观察细胞脱落和分离情况。

4. 胰酶消化的同时，准备 2X 细胞冻存液（FCS+ 20% DMSO）。

5. 在胰酶消化细胞中加 60 μl 培养基，吹吸分散细胞。

6. 在新的无菌 96 孔板每孔中加 50 μl 2X 细胞冻存液。

7. 取 50 μl 胰酶消化的 ES 细胞，直接加入冻存液中，吹吸一次混匀。细胞转移到 -80℃ 冻存，直至鉴定出具有预期表型的克隆。

8.  ES 分化培养基稀释剩余细胞，悬滴培养。

9. 体外分化后，鉴定具有预期 lacZ 表型的克隆，融化相应的冻存细胞，用于进一步分析。