材料与仪器
线性化转移基因 DNA 未分化 ES 细胞
电穿孔仪和电穿孔杯 neoR-MEF 滋养板 ES 生长培养基
电穿孔仪和电穿孔杯 neoR-MEF 滋养板 ES 生长培养基
步骤
1. 准备下列试剂和材料：
线性化转移基因 DNA（1 mg/ml，溶于无菌 TE）
未分化 ES 细胞
Bio-Rad 电穿孔仪和电穿孔杯
100 mm neoR-MEF 滋养板
ES 生长培养基
含 300 μg/ml G418 的 ES 生长培养基
2. 收获未分化 ES 细胞，以 107 /ml 悬于 ES 生长培养基。
3. 吸取无菌 DNA 加入电穿孔杯。加入 0.8 ml ES 细胞，轻轻吹吸混合，不要产生气泡。
4. 室温电穿孔 DNA/细胞混合物：250 μF，0.3 kV。
5. ES 生长培养基 1:10 稀释电穿孔细胞，接种 neoR-MEF 滋养层，密度为 106 细胞/100 mm 滋养板。放于 37℃ 湿润的 5% CO2 温箱。
6. 接种 48 小时后，换含 300 μg/ml G418 的培养基。
7. 隔天换液。
线性化转移基因 DNA（1 mg/ml，溶于无菌 TE）
未分化 ES 细胞
Bio-Rad 电穿孔仪和电穿孔杯
100 mm neoR-MEF 滋养板
ES 生长培养基
含 300 μg/ml G418 的 ES 生长培养基
2. 收获未分化 ES 细胞，以 107 /ml 悬于 ES 生长培养基。
3. 吸取无菌 DNA 加入电穿孔杯。加入 0.8 ml ES 细胞，轻轻吹吸混合，不要产生气泡。
4. 室温电穿孔 DNA/细胞混合物：250 μF，0.3 kV。
5. ES 生长培养基 1:10 稀释电穿孔细胞，接种 neoR-MEF 滋养层，密度为 106 细胞/100 mm 滋养板。放于 37℃ 湿润的 5% CO2 温箱。
6. 接种 48 小时后，换含 300 μg/ml G418 的培养基。
7. 隔天换液。
来源：丁香实验
