原理
多孔塑料培养板克隆细胞的主要过程是
1. 制备出1~2 细胞/毫升低密度的细胞悬悬液；
2. 向多孔塑料培养板各孔中分别接种细胞悬液0.5~1 ml，则每孔平均含1 个细胞。
3. 镜下检测每孔所含细胞数，标记下含单细胞的孔，置温箱培养，数日后凡在已标记的孔中有生长增殖的细胞群即为克隆细胞。
1. 制备出1~2 细胞/毫升低密度的细胞悬悬液；
2. 向多孔塑料培养板各孔中分别接种细胞悬液0.5~1 ml，则每孔平均含1 个细胞。
3. 镜下检测每孔所含细胞数，标记下含单细胞的孔，置温箱培养，数日后凡在已标记的孔中有生长增殖的细胞群即为克隆细胞。
材料与仪器
细胞
Hanks 培养液 胰蛋白酶
吸管 试管 吸管 计数器 培养板 加液器
Hanks 培养液 胰蛋白酶
吸管 试管 吸管 计数器 培养板 加液器
步骤
1. 消化
取健康待克隆细胞，吸出瓶内培养液，加消化液；
2. 低密度细胞悬液的制备
做克隆细胞时首先需先用消化法制备出分散成单个细胞悬液：然后稀释细胞，使之成为1~2 细胞/毫升悬液；最适宜细胞密度为1~2 细胞/ml 培养液；
3. 接种
先用吸管轻轻吹打细胞悬液，使混悬均匀，继用加样器向塑料培养板每孔内加0.5 毫升；接种时要迅速准确，争取在最短时间内加完，以免培养液蒸发，然后迅速盖好盖板，置CO2温箱培养；
4. 标记
培养过6~12 小时后，待细胞下沉并贴附于培养板孔底后，从温中取出，置倒置光显微镜台上，观察和标记下含单个细胞的孔，置CO2温箱培养；CO2箱内含有水槽，以保持箱内湿度。
在培养中一般无需换液，只有在细胞增长过于缓慢时才可进行换液。换液时先吸除旧培养基，但不要吸除过多，余少许，以免细胞干涸。然后再迅速补加新鲜克隆培养液，继续培养3~4 周。待孔内细胞增至500~600 个时，可进行分离培养；
5. 分离扩大培养
培养86~96 小进后进行观察。
挑选生长良好的单细胞克隆孔，先吸除旧培养液，用Hanks洗1~2 次，继加胰蛋白酶少许，加入量以能覆盖细胞群即可，如过多，应吸除多余消化液。
置于倒置显微镜下窥视，待发现细胞变圆时，加入0.1 ml 含10 %血清地克隆培养基，用吸管轻轻吹打，当细胞离开底物悬浮后，一并吸入管内，移入另瓶或皿中，再补加一定量克隆培养液，置CO2温箱中继续培养、增量，使之形成新的细胞群体后，即转用常规培养法培养。
取健康待克隆细胞，吸出瓶内培养液，加消化液；
2. 低密度细胞悬液的制备
做克隆细胞时首先需先用消化法制备出分散成单个细胞悬液：然后稀释细胞，使之成为1~2 细胞/毫升悬液；最适宜细胞密度为1~2 细胞/ml 培养液；
3. 接种
先用吸管轻轻吹打细胞悬液，使混悬均匀，继用加样器向塑料培养板每孔内加0.5 毫升；接种时要迅速准确，争取在最短时间内加完，以免培养液蒸发，然后迅速盖好盖板，置CO2温箱培养；
4. 标记
培养过6~12 小时后，待细胞下沉并贴附于培养板孔底后，从温中取出，置倒置光显微镜台上，观察和标记下含单个细胞的孔，置CO2温箱培养；CO2箱内含有水槽，以保持箱内湿度。
在培养中一般无需换液，只有在细胞增长过于缓慢时才可进行换液。换液时先吸除旧培养基，但不要吸除过多，余少许，以免细胞干涸。然后再迅速补加新鲜克隆培养液，继续培养3~4 周。待孔内细胞增至500~600 个时，可进行分离培养；
5. 分离扩大培养
培养86~96 小进后进行观察。
挑选生长良好的单细胞克隆孔，先吸除旧培养液，用Hanks洗1~2 次，继加胰蛋白酶少许，加入量以能覆盖细胞群即可，如过多，应吸除多余消化液。
置于倒置显微镜下窥视，待发现细胞变圆时，加入0.1 ml 含10 %血清地克隆培养基，用吸管轻轻吹打，当细胞离开底物悬浮后，一并吸入管内，移入另瓶或皿中，再补加一定量克隆培养液，置CO2温箱中继续培养、增量，使之形成新的细胞群体后，即转用常规培养法培养。
注意事项
1. 观察并挑选孔内确实仅含有一个细胞后，才可进行标记。观察时要特别注意孔底边缘部位，如细胞落于该处，可能由于直角部折光而观察不清，凡不能确认含一个细胞的孔者，不进行标记，以免发生假克隆。
2. 标记时要挑选含有健康细胞的孔（细胞体积适宜，轮廓清晰完整）。
3. 亦可接种到其它底物如碟皿中进行细胞克隆，但细胞易流动和克隆形成后不易分离。如仅为测定细胞克隆形成率，而不做单细胞分离，仍可用培养皿中培养法。
2. 标记时要挑选含有健康细胞的孔（细胞体积适宜，轮廓清晰完整）。
3. 亦可接种到其它底物如碟皿中进行细胞克隆，但细胞易流动和克隆形成后不易分离。如仅为测定细胞克隆形成率，而不做单细胞分离，仍可用培养皿中培养法。
来源：丁香实验
