特殊细胞培养实验

二倍体细胞培养方法与一般培养相同，关键在于传代，其传代程序为 1. 吸除旧培养液注入另瓶中； 2. 用BSS冲洗1 次； 3. 用0.25%胰蛋白酶消化，加入消化液量以仅覆盖住细胞层即可；作用1~5 分钟； 4. 待细胞附着松动、细胞质边缘卷起和间隔加大，便终止消化；为防止细胞丢失可不必再用BSS冲洗，直接向瓶中加入培养液（新旧培养液按2：1）新旧混合；

1. 支持物制备 （1）特制有机玻璃、特氟隆薄膜、玻璃等 其中以玻璃片和特氟隆薄膜最为多用。前者便于做各种固定、染色处理和观察；后者最适做电镜技术，允许做包埋和切片。 （2）加支持物培养法程序与一般培养法相同，只是在培养前需在培养瓶中加入已经消毒的支持物。特氟隆薄膜为定型菌包装产品，用时无菌条件下启封，用剪刀按需要剪成各种不同大小的块，于培养接种细胞前，先置入培养容器中即可。

一、适应性培养基 1. 培养同源细胞（未克隆前时的同一细胞）至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24~48 小时后，吸出所有培养液； 2. 离心 3000~4000 /分，离心10 分钟后，吸取上清液； 3. 滤过 再经直径0.22 μm滤孔的滤膜过滤，低温冻存贮备用；用时取1 分适应培养基+ 2 分培养基混合使用。 二、饲细胞

1. 消化 取健康待克隆细胞，吸出瓶内培养液，加消化液； 2. 低密度细胞悬液的制备 做克隆细胞时首先需先用消化法制备出分散成单个细胞悬液：然后稀释细胞，使之成为1~2 细胞/毫升悬液；最适宜细胞密度为1~2 细胞/ml 培养液； 3. 接种 先用吸管轻轻吹打细胞悬液，使混悬均匀，继用加样器向塑料培养板每孔内加0.5 毫升；接种时要迅速准确，争取

1. 琼脂铺底的培养瓶 30 ml无菌培养瓶，每瓶中加5 ml 2 %琼脂培养基，冷却，形成平坦底层后备用； 2. 取生长状态良好已联接成片的细胞，用弯头吸管伸入瓶内，把细胞层纵横割划成若干小区后，倒出培养液； 3. 加入0.25 %的胰蛋白酶液，在倒置显微镜下边消化边观察，当细胞小区边缘微卷起后便立即终止消化，倒出消化液，用Hanks轻轻漂洗一次（不洗亦可），加入新培养液

用微载体细胞培养的主要问题是选择合适类型的微载体和适宜的搅动速度。三种类型微载体都适宜各类细胞生长，目的在于如何获得最大量的细胞。另外应注意的是微载体对蛋白有一定的吸附能力，它们吸附率分别是总蛋白的4.3 %、2.7 %、1.1 %。所以使用血清的量最好不低于10 %。 1. 微载体选择 （1）先利用三种小量微载体做培养实验，观察细胞在一定时间内细胞的附着率和计算细胞数，以得到最大

1. 用大培养瓶增加含有铁芯的无毒的聚苯乙烯棒，在培养中进行电磁搅拌，使细胞不能贴壁而成悬浮培养，为此必须拥有能容纳电磁搅拌器的大型温箱。 2. 用试管培养细胞，把试管置入带有悬转鼓的特制温箱中进行培养，悬转鼓不停徐缓转动，干扰细胞贴壁遂成悬浮培养。悬浮培养允许培养较多量细胞，适于做细胞代谢和生化方面的研究。