细胞培养:特殊培养法

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细胞培养 （Cell Culture）专题：
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1）二倍体细胞培养法
二倍体细胞培养法与一般培养相同，关键在于传代，其传代程序为：
1.吸除旧培养液注入另瓶中。
2.用温BSS冲洗1次。
3.用0.25%温胰蛋白酶消化，加入消化液量以仅覆盖细胞层即可；作用1~5分钟。
4.待细胞附着松动、细胞质边缘卷起和间隔加大，便终止消化。为防止细胞丢失，可不必再用BSS冲洗，直接向瓶中加入培养液（新旧培养液按2：1新旧混合）。
5.轻轻反复吹打制成单个细胞悬液。
6.按一分为二比例接种培养。

2）支持物培养法
加支持物培养法与一般培养法相同，只是在培养前需在培养瓶中加入已经消毒的支持物。
1.支持物制备：如用特氟隆薄膜，无菌条件下启封，用剪刀按需要剪成各种不同大小的块，于培养接种细胞前，先置入培养容器中即可；通常多用盖玻片做支持物，用前先要把盖片用玻璃刀切成一定形态，以便装入培养瓶中，然后按如下顺序处理：自来水浸泡24小时—96%酒精30～60 min—蒸馏水浸泡30～60 min—用干净软布擦拭干净—装入培养皿中—高压或干热灭菌备用。
2.培养法：初代消化培养、初代组织块培养、传代培养 等皆可应用加支持物培养法。接种细胞后，可在任何时间取出支持物，做各种观察或实验。

3）细胞分离（克隆）培养
多孔塑料培养板单细胞克隆法：
1. 消化：取健康待克隆细胞，吸出瓶内培养液，加消化液。
2. 低密度细胞悬液的制备：做克隆细胞时首先需先用消化法制备出分散成单个细胞悬液，然后稀释细胞，使之成为1~2细胞/毫升悬液，最适宜细胞密度为1~2细胞/ml培养液。
3. 接种：先用吸管轻轻吹打细胞悬液，使混悬均匀，继用加样器向塑料培养板每孔内加0.5毫升。接种时要迅速准确，争取在最短时间内加完，以免培养液蒸发，然后迅速盖好盖板，置CO2温箱培养。
4. 标记：培养6~12小时后，待细胞下沉冰贴附于培养板孔底后，从温箱中取出，置倒置光显微镜台上，观察和标记下含有单个细胞的孔，置CO2温箱培养。在培养中一般无需换液，只有在细胞增长过于缓慢时才可进行换液。换液时先吸除旧培养基，但不要吸除过多，余少许，以免细胞干涸。然后再迅速补加新鲜克隆培养液，继续培养3~4周。待孔内细胞增至500~600个时，可进行分离培养。
5. 分离扩大培养：培养86~96小时后进行观察。挑选生长良好的单细胞克隆孔，先吸除旧培养液，用Hanks洗1~2次，继加胰蛋白酶少许，加入量已能覆盖细胞群即可，如过多，应吸除多余消化液。置于倒置显微镜下窥视，待发现细胞变圆时，加入0.1ml含10%血清的克隆培养基，用吸管轻轻吹打，当细胞离开底物悬浮后，一并吸入管内，移入另瓶或皿中，再补加一定量克隆培养液，置CO2温箱中继续培养、增殖，使之形成新的细胞群后，即转用常规培养法培养。

必须保证分离出来的细胞确为一个而不是两个或更多。因此必须提高克隆形成率才易克隆成功，为此常采取以下一些措施：
使用适应性培养基或条件培养基（Conditional Medium）。制备方法：
1.培养同源细胞（未克隆前时的同一细胞）至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24~48小时后，吸出所有培养液。
2.离心：3000~4000/分离心10分钟，吸取上清液。
3.滤过：再经直径0.22μm滤孔的滤膜过滤，低温冻存贮备用；用时取1分适应培养基+2分培养基混合使用。